李 娜 趙興蓉 胡 靜 王廷華 許秀峰 (昆明醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院精神科，云南 昆明 650032)

文拉法辛對老年抑郁大鼠海馬血管內皮生長因子表達的影響

李 娜 趙興蓉 胡 靜 王廷華1許秀峰 (昆明醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院精神科，云南 昆明 650032)

目的 探討抗文拉法辛對老年抑郁大鼠海馬血管內皮生長因子(VEGF)表達的影響。方法 老年雄性SD大鼠，隨機分為3組，模型組、文拉法辛組各12只均給予慢性不可預測的溫和多相應激結合孤養(yǎng)共5 w，文拉法辛組于應激第3周末開始同時給予文拉法辛(5 mg·kg-1·d-1)治療持續(xù)14 d，模型組同時給予生理鹽水14 d。對照組12只不給予任何處理。采用敞箱實驗和糖水消耗實驗觀察大鼠抑郁建模情況。采用免疫印跡檢測海馬VEGF蛋白表達，逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測VEGF mRNA表達。結果 敞箱實驗、液體消耗實驗顯示模型組及文拉法辛組抑郁模型建立成功。與模型組比較，文拉法辛組垂直得分增高，蔗糖消耗增加(P均＜0.05)。與對照組比較，文拉法辛組海馬VEGF蛋白及VEGF mRNA表達均增加(P＜0.05，P＜0.01);模型組海馬VEGF蛋白及VEGF mRNA表達均下降(P＜0.05)。文拉法辛組與模型組比較，文拉法辛組VEGF蛋白及VEGF mRNA表達均明顯增加(P＜0.01)。結論 文拉法辛可提高老年抑郁大鼠VEGF表達，并對血管新生可能起到促進作用。

老年抑郁;海馬;文拉法辛;血管內皮生長因子

血管新生是一個動態(tài)發(fā)展的過程，期間受多種血管特異性生長因子的調控。其中血管內皮細胞生長因子(VEGF)可促進內皮細胞存活、增殖、遷移，增加血管通透性、促進毛細血管融合〔1，2〕，因而對血管新生起到促進作用。文拉法辛作為選擇性5-羥色胺和去甲腎上腺素再攝取抑制劑，抗抑郁療效顯著，但其對血管新生的作用及作用機制如何，目前尚無相關研究。本研究擬通過應用文拉法辛對慢性應激抑郁老年大鼠模型進行干預，觀察其對老年抑郁大鼠海馬VEGF蛋白和VEGF mRNA表達的影響，進一步探討文拉法辛對老年抑郁障礙的血管新生的影響，為老年抑郁障礙的發(fā)病機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性SD老年大鼠36只(20月齡)，由成都達碩生物科技有限公司提供，許可證號：SCXK(川)2008-24，動物合格證號：0012758。大鼠體質量(650±50)g。

1.2 實驗藥品 文拉法辛由成都大西南制藥有限公司生產(chǎn)并贈送，25 mg/粒，批準文號：準：H19980051。

1.3 實驗試劑 兔抗鼠VEGF多克隆抗體(Santa crudz公司)、兔抗鼠β-actin單克隆抗體(Abmart公司)、Western印跡試劑盒(Merck公司)、羊抗兔 IgG-HRP(abmart公司)、Trizol試劑(Molecular Reseach Center TR 118)，RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit及 dNTPS(Fermentas Company)，DNA Ladder Marker(寶生物工程 D513A)。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組及建模方法 大鼠購自后進行適應性飼養(yǎng)1 w。1 w后大鼠按體質量排序后根據(jù)隨機數(shù)字表將大鼠隨機分為文拉法辛組(n=12)、模型組(n=12)、對照組(n=12)。應激前1 d各組進行敞箱實驗和蔗糖消耗實驗，結束后對照組不進行任何處理，自由進食及攝水，以4只/籠飼養(yǎng)。其余兩組大鼠均采用單籠飼養(yǎng)加慢性不可預測的溫和多相應激方法(CUMS)共5 w，根據(jù)文獻并結合本課題組長期實踐經(jīng)驗，對應激方法進行改良〔2〕。于應激后3、5 w末各組均進行敞箱實驗和蔗糖消耗實驗。試驗5 w結束后各組即取標本。

1.4.2 給藥方法 文拉法辛組于應激后第3周末開始文拉法辛5 mg·kg-1·d-1腹腔注射，劑量的選擇根據(jù)相關文獻確定〔3〕，使用無菌雙蒸水稀釋，稀釋濃度5 ml/kg，每日新鮮配制。模型組同時行0.9%生理鹽水腹腔注射，注射劑量5 ml/kg。均持續(xù)注射14 d〔4〕，注射時間固定在每日應激前。

1.4.3 抑郁模型評估方法 于應激前1 d、應激第3周末、應激第5周末進行敞箱實驗和蔗糖消耗實驗。

1.4.3.1 敞箱實驗 實驗在安靜環(huán)境及自然光線下進行，將大鼠小心置于方箱底面中央格，同時進行計時。2 min后更換動物繼續(xù)實驗。兩者之間用體積分數(shù)為10%的酒精清洗方箱周壁及底面，以免上次動物余留的異味影響下次實驗結果。觀察指標及計分方法：觀察大鼠2 min內越過的方格數(shù)(大鼠4只腳均在同一格子內為一格)為水平得分，穿越一格計1分;后肢站立次數(shù)為垂直得分，雙足離地一次計1分;兩者之和為敞箱總得分。此外，觀察中央格停留時間、清潔時間、糞便粒數(shù)。

1.4.3.2 蔗糖消耗實驗 于適應性飼養(yǎng)期間，每籠同時放置2個水瓶，均為1%蔗糖水，以后的連續(xù)2 d，每籠同時放置2個水瓶，為一瓶1%蔗糖水，一瓶純水。應激前2 d禁水禁食24 h，應激前1 d進行1 h蔗糖消耗實驗，即每籠同時放置2個實驗前已稱重的水瓶，為一瓶1%蔗糖水，一瓶純水，于1 h后移走兩瓶水并分別稱重。計算動物的基礎糖水消耗(實驗前糖水重量-實驗后糖水重量)、純水消耗(實驗前純水重量-實驗后純水重量)、總液體消耗(糖水消耗+純水消耗)、糖水偏愛(糖水消耗/總液體消耗 )。

1.4.4 Western印跡 大鼠直接斷頭處死，冰浴上取出左側海馬組織并稱重，按80 mg/ml加入裂解液;冰浴勻漿法提取組織總蛋白;BCA法測定蛋白質含量;SDS-PAGE凝膠電泳配制;轉移槽轉印蛋白質到PVDF膜;5%脫脂奶粉常溫1 h封閉;加入一抗VEGF(1∶1 000)室溫孵育2 h，TBST漂洗10 min×2次，TBS洗一次，10 min;加入二抗(羊抗兔IgG-HRP)室溫孵育2 h，TBST漂洗10 min×2次，TBS洗一次，10 min;ECL液顯影免疫復合物，3個樣/張;用計算機圖像分析系統(tǒng)軟件IMAGE J分析測定VEGF及內參照β-actin的電泳條帶平均光密度值，用VEGF/β-actin的平均光密度值比值進行比較。

1.4.5 RT-PCR反應 大鼠直接斷頭處死，冰浴上取出右側海馬，放入含0.1%的DEPC水中稍作漂洗，立即放入細胞凍存管中，液氮速凍后，放入-70℃ 冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｓ肨rizol常規(guī)方法提取海馬總RNA，紫外分光光度計測RNA樣品的純度，測OD260/280值，計算RNA濃度。1.5%甲醛變性瓊脂糖凝膠鑒定RNA質量。取2 μg總RNA經(jīng)逆轉錄酶M-MLV催化合成cDNA。VEGF和內參照β-actin引物由大連寶生物公司設計并合成。VEGF引物序列：正義鏈為5'-AAGCCCATGAAGTGGTGAA-3'，反義鏈為 5'-CAGTGAACGCTCCAGGATTTA-3'，產(chǎn)物大小為394 bp;β-actin引物序列：正義鏈為5'-TGTGCTGTCCCTGTACGCCTCT-3'，反義鏈為 5'-CCTTAATGTCACGCACGATTTCC-3'，產(chǎn)物大小為227 bp。PCR反應條件：94℃ 預變性3 min，94℃變性 30 s，退火 30 s(VEGF 50℃、β-actin 56℃)，72℃延伸30 s，35個循環(huán)，720C終延伸10 min得到擴增產(chǎn)物。10 μl PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳及溴化乙啶染色后，用凝膠成像儀紫外模式下攝取凝膠圖片，采用BIO-GEL 2.0型全自動圖像分析系統(tǒng)進行半定量分析，計算目的基因擴增條帶與β-actin條帶平均光密度值的比值，以表示VEGF mRNA表達水平。

1.5 統(tǒng)計分析 用SPSS16.0進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)用±s表示，采用t檢驗及單因素方差分析，應用LSD及Dunnett檢驗。

2 結果

2.1 敞箱實驗結果 應激后5 w，與對照組比較，文拉法辛組、模型組水平得分、垂直得分、活動得分降低(P＜0.01，P＜0.05);模型組清潔時間明顯縮短(P＜0.01)。應激后5 w，與模型組比較，文拉法辛組垂直得分增高(P＜0.05)。見表1。

表1 各組應激前后敞箱實驗變化(±s)

表1 各組應激前后敞箱實驗變化(±s)

與對照組比較：1)P＜0.05，2)P＜0.01;與模型組比較：3)P＜0.05，4)P＜0.01;下表同

組別 項目 應激前1 d 應激后3 w 應激后5 w文拉法辛組(n=12) 水平得分 27.38±14.84 14.88±15.98 9.38±6.842)垂直得分 5.50±4.14 3.25±4.10 2.38±3.341)3)活動得分 32.88±18.40 18.13±19.91 11.63±9.292)中央格停留時間(s)5.52±8.50 7.20±6.42 2.59±3.11清潔時間(s) 13.15±7.79 5.45±6.21 4.44±4.82糞便顆粒 1.13±1.55 1.63±1.30 3.13±2.10模型組(n=12) 水平得分 28.50±15.57 15.63±14.16 2.88±1.812)垂直得分 5.88±4.09 2.63±1.85 0.14±0.382)活動得分 34.38±17.86 18.25±15.54 3.00±1.852)中央格停留時間(s)4.69±5.29 3.57±5.48 9.49±9.88清潔時間(s) 11.88±6.28 2.11±3.55 0.32±0.612)糞便顆粒 2.00±1.85 2.38±1.41 2.29±2.14對照組(n=12) 水平得分 27.33±13.25 27.17±14.16 26.67±13.41垂直得分 5.83±3.31 6.50±1.87 6.33±2.58活動得分 33.17±16.03 33.50±15.40 33.00±15.15中央格停留時間(s)5.23±4.43 4.80±4.13 4.80±3.98清潔時間(s) 8.88±7.67 7.82±5.76 9.28±8.11糞便顆粒1.17±1.33 1.50±1.38 1.00±0.89

2.2 蔗糖消耗實驗結果 應激后5 w，與對照組比較，模型組蔗糖消耗顯著減少(P＜0.01)。與模型組比較，文拉法辛組蔗糖消耗增加(P＜0.05)。見表2。

2.3 VEGF Western印跡結果 各組均檢測到1條分子量約42 kD特異性蛋白條帶(見圖1)，與已知的VEGF蛋白分子量一致。與對照組比較，文拉法辛組海馬VEGF表達增加(P＜0.05);模型組VEGF表達下降(P＜0.05)。與模型組比較，文拉法辛組海馬VEGF表達明顯增加(P＜0.01)。見表3。

2.4 VEGF mRNA RT-PCR結果 RT-PCR方法獲得大約394 bp的PCR條帶(見圖2)。與對照組比較，文拉法辛組海馬VEGF mRNA表達顯著增加(P＜0.01);模型組VEGF mRNA表達降低(P＜0.05)。與模型組比較，文拉法辛組VEGF mRNA表達顯著增加(P＜0.01)。見表3。

表2 各組大鼠應激前后蔗糖消耗實驗變化(±s)

表2 各組大鼠應激前后蔗糖消耗實驗變化(±s)

組別 應激前1 d 應激后3 w 應激后5 w文拉法辛組(n=12)蔗糖消耗(g) 13.44±4.79 12.08±4.20 11.16±3.413)純水消耗(g) 2.18±0.65 2.75±1.29 2.68±1.23蔗糖偏愛 0.85±0.06 0.80±0.11 0.80±0.07模型組(n=12) 蔗糖消耗(g) 14.31±3.30 11.60±3.68 7.23±2.442)純水消耗(g) 2.66±1.07 2.56±0.85 2.88±1.72蔗糖偏愛 0.84±0.06 0.81±0.07 0.68±0.10對照組(n=12) 蔗糖消耗(g) 12.73±3.86 12.43±3.40 12.90±3.52純水消耗(g) 2.27±1.78 2.73±1.65 2.75±1.56蔗糖偏愛0.85±0.10 0.82±0.10 0.82±0.08

表3 Western印跡及RT-PCR法測定各組大鼠海馬VEGF蛋白、VEGF mRNA表達情況( ± s，n=12)

表3 Western印跡及RT-PCR法測定各組大鼠海馬VEGF蛋白、VEGF mRNA表達情況( ± s，n=12)

組別 VEGF平均光密度值 VEGF mRNA 平均光密度值文拉法辛組 0.67±0.061)4) 0.43±0.102)4)模型組 0.36±0.021) 0.25±0.071)對照組0.47±0.12 0.33±0.08

圖1 各組大鼠海馬VEGF蛋白免疫印跡圖

圖2 各組大鼠海馬VEGF mRNA電泳圖

3 討論

VEGF是內皮細胞特異性的促有絲分裂原，是公認的刺激血管新生的最強因子之一〔4〕，其表達受多種因素調控，目前認為缺血導致局部組織缺氧是主要的刺激因素，組織缺氧的發(fā)生可以提升細胞內缺氧誘導因子(HIF-1α)蛋白的水平，進而上調VEGF的表達〔5〕。在本研究中，三組VEGF蛋白及基因均有表達。就對照組而言，其表達可能與大鼠衰老導致血管自身退變、腦血流灌注減少以及 HIF-1α的作用有關〔6〕。而模型組VEGF蛋白及基因表達均低于對照組，此結果與多數(shù)研究結論一致〔7〕。推測降低原因一方面與高皮質醇的調節(jié)作用有關。慢性應激可以上升血中皮質醇的水平，升高的皮質醇能抑制血管平滑肌、成骨細胞和腎上腺中VEGF的表達，并明顯降低海馬齒狀回顆粒細胞層下區(qū)VEGF及其受體KDR/Flk-1的水平，進一步抑制血管新生〔8〕。另一方面，VEGF表達水平的變化也與時間有密切關系，在血管新生的早期階段其表達可明顯增高，隨時間的延長表達逐漸降低，數(shù)個研究顯示分界點為7 d〔9〕。本研究中，VEGF蛋白及基因表達的測定時間為5 w末，已遠遠超過上述分界時間點。應激初期海馬神經(jīng)元缺血缺氧導致的VEGF代償性增高隨應激時間的不斷延長，可能已轉入后期的VEGF合成失代償狀態(tài)，同時合并其他抗血管新生因子的表達增高，繼而出現(xiàn)VEGF水平下降，最終血管新生可能受抑而加重神經(jīng)元的損傷〔10〕。故促進血管新生有賴于內、外源性干預等措施〔11〕，其中外源性干預是目前主要的研究方向。

抗抑郁藥物文拉法辛，早期的研究認為“單胺學說”即其抗抑郁機制。近來更新的研究表明單胺類神經(jīng)遞質(NT)和NT受體可能只是其抗抑郁作用的開始，最終產(chǎn)生的療效與后續(xù)的神經(jīng)適應性變化有關〔12〕。而VEGF可能參與了此種適應性變化過程繼而發(fā)揮抗抑郁樣活性〔13〕。一方面，抗抑郁治療后上抬的VEGF及其所促進的血管新生對于支持海馬神經(jīng)元的再生提供了一個重要而有利的血管環(huán)境。另一方面，升高的VEGF也可通過受體KDR/Flk-1及多個信號通路直接促進神經(jīng)干細胞增殖，增加神經(jīng)元和膠質細胞數(shù)量，并起到神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護作用〔14〕。本研究提示文拉法辛可提高老年抑郁大鼠VEGF表達。對于文拉法辛致VEGF升高的原因尚不清楚，可能與多種機制有關。有資料顯示帕羅西汀等抗抑郁藥物可作用于糖皮質激素受體，增加其對糖皮質激素的結合能力，恢復其受體活性，從而使HPA軸對糖皮質激素的反饋作用更加敏感，拮抗過量的皮質醇〔15〕。本研究文拉辛機制可能也與此有關。此外，藥物還可通過G蛋白影響細胞內信號轉導，提高環(huán)磷酸腺苷(CAMP)濃度，導致CAMP信號級聯(lián)及其下游CAMP反應元件結合蛋白(CREB)等發(fā)生變化，激活蛋白激酶A(PKA)和蛋白激酶C(PKC)，并促進轉錄因子磷酸化，誘導轉錄基因表達，使VEGF及其受體表達上調，從而發(fā)揮抗抑郁作用〔16〕。第三，文拉法辛可能類似其他抗抑郁藥物，尚可通過活化的5羥色胺2(5-HT2)受體直接增加海馬的血管內皮細胞的數(shù)量并促進其增殖，進而上調VEGF的表達。而究竟是何具體機制，尚需進一步的研究加以論證。

1 Rasmussen HS，Rasmussen CS，Macko J.VEGF gene therapy for coronary artery disease and peripheral vascular disease〔J〕.Cardiovasc Radiat Med，2002;(3)：114-7.

2 Post MJ，Laham R，Sellke FW，et al.Therapeutic angiogenesis in cardiology using protein formulations〔J〕.Cardiovasc Res，2001;49(3)：522-31.

3 Xu H，Steven Richardson J，Li XM.Dose-related effects of chronic antidepressants on neuroprotective proteins BDNF，Bcl-2 and Cu/Zn-SOD in rat hippocampus〔J〕.Neuropsychoharmacology，2003;28(1)：53-62.

4 Willner P.Chronic mild stress(CMS)revisited：consistency and behavioural-neurobiological concordance in the effects of CMS〔J〕.Neuropsy-chobiology，2005;52(2)：90-110.

4 Shen F，Su H，F(xiàn)an Y，et al.Adeno-associated viral-vector-mediated hypoxia-inducible vascular endothelial growth factor gene expression attenuates ischemic brain injury after focal cerebral ischemia in mice〔J〕.Stroke，2009;37(10)：2601-6.

5 Shen F，F(xiàn)an Y，Su H，et al.Adeno-associated viral vector-mediated hypoxia-regulated VEGF gene transfer promotes angiogenesis following focal cerebral ischemia in mice〔J〕.Gene Ther，2008;15(1)：30-9.

6 Hoehn BD，Harik SI，Hudetz AG，et al.VEGF mRNA expressed in microvessels of neonatal and adult rat cerebral cortex〔J〕.Mol Brain Res，2002;101(1-2)：103-8.

7 Greene J，Banasr M，Lee B，et al.Vascular endothelial growth factor signaling is required for the behavioral actions of antidepressant treatment：pharmacological and cellular characterization〔J〕.Neuropsychopharmacology，2009;34(11)：2459-68.

8 Heine VM，Zareno J，Maslam S，et al.Chronic stress in the adult dentate gyrus reduces cell proliferation near the vasculature and VEGF and Flk-1 protein expression〔J〕.Eur J Neurosci，2005;21(5)：1304-14.

9 Choi JS，Kim HY，Cha JH，et al.Up regulation of vascular endothelial growth factor receptors Flt-1 and Flk-1 in rat hippocampus after transient forebrain ischemia〔J〕.J Neurotrauma，2007;24(3)：521-31.

10 Navailles S，Hof PR，Schauss C.Antidepressant drug-induced stimulation of mouse hippocampal neurogenesis is age-dependent and altered by early life stress〔J〕.J Comp Neurol，2008;509(4)：372-81.

11 Zhang S，Zhang P，Guo J.Enhanced cytoprotection and angiogenesis by bone marrow cell transplantation may contribute to improved ischemic myocardial function〔J〕.Eur J Cardiothorac Surg，2004;(25)：188-95.

12 Boldrini M，Underwood MD，Hen R，et al.Antidepressants increase neural progenitor in the human hippocampus〔J〕.Neuropsychopharmacology，2009;34(11)：2376-89.

13 Palmer TD，Willhoite AR，Gage FH.Vascular niche for adult hippocampal neurogenesis〔J〕.J Comp Neurol，2000;425(4)：479-94.

14 Sun Y，Jin K，Childs JT，et al.Vascular endothelial growth factor-B(VEGFB)stimulates neurogenesis：evidence from knockout mice and growth factor administration〔J〕.Dev Biol，2006;289(2)：329-35.

15 Par Iante CM，Miller AH.Glucocorticoid receptors in major depression：relevance to pathophysiology and treatment〔J〕.Biol Psychiatry，2001;49(5)：391-404.

16 Sairanen M，Lucas G，Ernfors P，et al.Brain-derived neurotrophic factor and antidepressant drugs have different but coordinated effects on neuronal turnover，proliferation，and survival in the adult dentate gyrus〔J〕.J Neurosci，2005;25(5)：1089-94.

Effect of Venlafaxine on vascular endothelial growth factor in hippocampus in elderly rat model of depression

LI Na，ZHAO Xing-Rong，HU Jing，et al.
The First Hospital Affiliated Kunming Medical College，Kunming 650032，Yunnan，China

Objective To study the effect of antidepressant Venlafaxine on vascular endothelial growth factor(VEGF)in hippocampus in elderly rat model of depression.Methods 36 SD male rats in elder(20 months)were randomly and divided into 3 groups：venlafaxine，model and blank matched control group.Separation and chronic mild stress were used to establish depression in all rats except those in the blank matched control group for 5 weeks.Behavior of all animals was evaluated by open-field and fluid consumption test.VEGF expressions were detected by Western blot and RT-PCR after intraperitoneal injection respectively with venlafaxine to venlafaxine group or normal sodium to the model group at third weekend for 14 d.Results Venlafaxine group and the model group were established depression model successfully assessed by open-field and fluid consumption test.Compared with the blank control group，VEGF protein and VEGF mRNA expression in hippocampus were obviously increased in venlafaxine group(P＜0.01 or P＜0.05);but decreased in the model group(P＜0.05).After venlafaxine administration for 14 d，VEGF protein and VEGF mRNA expression in hippocampus were significantly increased in venlafaxine group than those of model group(P＜0.01).Conclusions Antidepressant venlafaxine treatment may increases VEGF expression in hippocampus of elderly rat depression model and promote angiogenesis.

Elderly depression;Hippocampus;Venlafaxine;Vascular endothelial growth factor

R749.4

A

1005-9202(2012)17-3713-04;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.17.046

云南省中青年學術和技術帶頭人后備人才培養(yǎng)(2004PY01-28);云南省教育廳科學研究基金項目(2010Y172)

1 昆明醫(yī)學院神經(jīng)科學研究所

王廷華(1968-)，男，教授，博士生導師，主要從事神經(jīng)元再生的基礎研究。許秀峰(1962-)，男，教授，碩士生導師，主要從事抑郁障礙的臨床與基礎研究。

李 娜(1975-)，女，主治醫(yī)師，在讀博士，主要從事老年抑郁障礙臨床與基礎研究。

〔2011-08-15收稿 2011-12-30修回〕

(編輯 曹夢園)