魏云鴻 金醒昉 何 燕 楊文慧 (昆明市延安醫(yī)院 云南省老年病研究中心，云南 昆明 650051)

老年腦梗死患者熱休克蛋白70-1基因的多態(tài)性

魏云鴻 金醒昉 何 燕 楊文慧 (昆明市延安醫(yī)院 云南省老年病研究中心，云南 昆明 650051)

目的 探討熱休克蛋白70(Hsp70)-1基因多態(tài)性與老年腦梗死之間的關(guān)系。方法 采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法檢測101例老年腦梗死患者(其中包括腦梗死并高血壓患者67例和腦梗死不合并高血壓患者34例)、115例老年高血壓患者和100例老年健康者Hsp70-1+190位點(diǎn)基因多態(tài)性。結(jié)果 老年腦梗死組Hsp70-1+190位點(diǎn)GC基因型所占比例(59.41%)高于老年健康組(36%)(P=0.001)。老年腦梗死不合并高血壓組Hsp70-1 GC基因型所占比例(82.35%)分別高于老年腦梗死并高血壓組(47.76%)、老年高血壓組(45.22%)、老年健康組(36%)，OR 值分別為5.104(95%CI：1.871 ～13.925，P=0.001)、5.654(95%CI：2.175 ～14.695，P ＜0.001)、8.296(95%CI：3.140～21.922)(P＜0.000 1)。結(jié)論 Hsp70-1基因多態(tài)性與老年腦梗死遺傳易感性有關(guān);檢測Hsp70-1+190位點(diǎn)基因多態(tài)性將可能作為預(yù)測腦梗死發(fā)生的一項(xiàng)重要指標(biāo)。

熱休克蛋白70-1;腦梗死;高血壓;基因多態(tài)性

許多證據(jù)表明遺傳因素在腦梗死的發(fā)病中有顯著作用，腦梗死是由多個(gè)基因和環(huán)境因素共同作用導(dǎo)致的一類極其復(fù)雜的疾病。遺傳因素在腦梗死的病理生理方面起著十分重要的作用。而熱休克蛋白(Hsp)70作為熱休克蛋白中最突出和最具特征性的一類，它主要參與機(jī)體耐受的形成〔1〕。當(dāng)細(xì)胞或機(jī)體應(yīng)激時(shí)，Hsp70蛋白生成顯著增加，避免機(jī)體再次應(yīng)激時(shí)遭受更為嚴(yán)重的損傷。研究顯示，Hsp70蛋白水平的動(dòng)態(tài)變化與缺血性腦梗死及其病情的輕重密切相關(guān)〔2〕。Hsp70基因多態(tài)性是否與腦梗死相關(guān)，國內(nèi)外鮮有報(bào)道。為此，本研究對(duì)老年腦梗死患者與Hsp70-1基因多態(tài)性關(guān)系進(jìn)行了一定的探討。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 (1)病例組選自2007年1月至2010年7月間云南省昆明市延安醫(yī)院干療/老年病科住院患者，包括老年腦梗死(均為動(dòng)脈硬化性腦梗死，以后簡稱腦梗死)組101例(包括腦梗死并高血壓組患者67例，腦梗死不合并高血壓組患者34例)、老年高血壓組115例，均為昆明地區(qū)漢族;所有病例高血壓診斷符合1999年世界衛(wèi)生組織與國際高血壓學(xué)會(huì)制定的高血壓診斷標(biāo)準(zhǔn)，腦梗死診斷符合《實(shí)用內(nèi)科學(xué)》第12版制定的動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死的診斷標(biāo)準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均排除瓣膜性心臟病、雙下肢靜脈血栓、房顫、血液病、顱內(nèi)腫瘤、腦血管畸形或動(dòng)脈瘤等引起的繼發(fā)性腦卒中。(2)老年健康組來自研究期間就診于云南省昆明市延安醫(yī)院體檢中心的昆明地區(qū)漢族人群，經(jīng)各項(xiàng)體檢健康，并排除高血壓、腦梗死、神經(jīng)、心理疾病、自身免疫性疾病、癌癥及其他慢性疾病。三組研究對(duì)象年齡、性別、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)和尿酸(UA)之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。見表1。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本采集 受檢者禁食12 h后，于清晨取用EDTA抗凝管取靜脈血2 ml，并將血標(biāo)本保存于-80℃冰箱中準(zhǔn)備提取基因組DNA。

1.2.2 DNA的提取 基因組DNA的提取使用AXYGEN公司“AxyPrep血基因組DNA試劑盒”從全血中提取并保存于-80℃冰箱中。

1.2.3 目的片段聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) (1)用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物序列，由上海生物工程有限公司(Sangon)合成，上游引物5'-AAAGGCGGGTCTCCGTGAC-3'，下游引物5'-TTGGCGATGATCTCCACCTT-3'，PCR目的片段長度為359 bp。(2)PCR反應(yīng)：PCR 反應(yīng)體系為25 μl，包括Fermentas公司PCR Master Mix(2 × )12.5 μl、上下游引物各 0.5μl、DNA 模板 3 μl，使用：美國BIO-RAD公司梯度PCR儀進(jìn)行反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件為95oC變性 5 min 后，按 95℃變性 30 s，56℃退火30 s，72℃延伸 30 s，反復(fù)循環(huán)35次，最后72℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增后，取2 μl PCR反應(yīng)產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)。

1.2.4 限制性內(nèi)切酶法檢測Hsp70-1基因型 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶BrsB I(Fermentas公司)在37℃恒溫箱中消化24 h，359 bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物DNA被BrsB I酶切后用2%瓊脂糖凝膠電泳分析酶切片段，若出現(xiàn)116和243 bp兩條條帶，判定為GG純合基因型;若出現(xiàn)116、243和359 bp三條條帶，判定為GC雜合基因型;若出現(xiàn)359 bp一條條帶，判定為CC純合基因型。

1.2.5 基因測序 對(duì)Hsp70-1 PCR擴(kuò)增后的目的條帶進(jìn)行基因測序，每種基因型不少于10%的檢測量，未被酶切開的一條帶純合基因型全部送檢(基因測序委托上海生工完成，所用測序儀器為ABI-PRISM3730，測序試劑為BigDyeterminator v3.1)。將測序結(jié)果與酶切結(jié)果比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，符合率達(dá)100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以±s表示，兩組之間計(jì)量資料比較用t檢驗(yàn)，兩組以上比較采用單向方差分析;計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和百分比表示，計(jì)數(shù)資料比較用χ2檢驗(yàn)。采用Logistic回歸分析計(jì)算特定危險(xiǎn)因素的比值比(OR)及其95%置信區(qū)間(CI)。

2 結(jié)果

2.1 各組基本資料比較 各組基本資料比較見表1。各組研究對(duì)象除空腹血糖(FPG)、高密度脂蛋白(HDL)比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)外，五組研究對(duì)象的性別、年齡、TC、TG、LDL和UA之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。

2.2 Hsp70-1 PCR反應(yīng)產(chǎn)物 電泳后，紫外燈下顯示359 bp電泳帶，見圖1。經(jīng)BrsB I內(nèi)切酶酶切后，若酶切結(jié)果出現(xiàn)116和243 bp兩條條帶，判定為GG純合基因型;若出現(xiàn)116、243和359 bp三條條帶，判定為GC雜合基因型;若出現(xiàn)359 bp一條條帶，判定為CC純合基因型。電泳結(jié)果見圖2?；驕y序驗(yàn)證結(jié)果見圖3。

表1 各實(shí)驗(yàn)組的基本資料比較

圖1 Hsp70-1 PCR擴(kuò)增目的片段的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

圖2 Hsp70-1 PCR酶切產(chǎn)物電泳圖

2.3 基因型結(jié)果

2.3.1 Hsp70-1+190位點(diǎn)各基因型在腦梗死組和健康組中的分布 Hsp70-1基因型在腦梗死組和健康組中的分布頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，與健康組相比，Hsp70-1 GC基因型在腦梗死組中明顯升高，達(dá)59.41%，OR為2.602(95%CI：1.472 ～ 4.599)(P=0.001)，說明攜帶 Hsp70-1 GC基因型的個(gè)體發(fā)生腦梗死的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加。而C、G等位基因分布頻率在腦梗死和健康組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表2。

圖3 Hsp70-1 PCR擴(kuò)增目的條帶測序圖

2.3.2 Hsp70-1+190位點(diǎn)各基因型及等位基因在腦梗死并高血壓組、腦梗死不合并高血壓組、單純高血壓組和健康組中的分布 四組間基因型分布頻率比較：腦梗死不合并高血壓組與腦梗死并高血壓組、單純高血壓組、健康組相比，具有顯著差異(P＜0.005);其余兩組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，腦梗死不合并高血壓組Hsp70-1 GC基因型所占比例明顯升高，達(dá)82.35%，與健康組比較，OR值為8.296(95%CI為3.140～21.922)(P＜0.000 1)，提示攜帶Hsp70-1 GC基因型的個(gè)體在無高血壓的情況下，發(fā)生腦梗死的風(fēng)險(xiǎn)比另兩種基因型更大。腦梗死不合并高血壓組Hsp70-1 GC基因型所占比例明顯升高，與腦梗死并高血壓組、單純高血壓組比較，OR值分別為5.104(95%CI為1.871 ～13.925，P=0.001)、5.654(95%CI為2.175～14.695，P＜0.001)。見表2。四組間基因頻率分布比較：腦梗死不合并高血壓組與健康組相比，C與T等位基因頻率存在顯著差異(P=0.002)，危險(xiǎn)度估計(jì)值OR值為2.530，95%CI為1.429～4.480，提示腦梗死不合并高血壓發(fā)病率與G、C等位基因頻率有關(guān)，即有C等位基因的人群中腦梗死的發(fā)生率較G等位基因更大。腦梗死不合并高血壓組與單純高血壓組相比，有顯著差異(P=0.008)，危險(xiǎn)度估計(jì)值OR值為2.209，95%CI為1.268～3.849。其余兩組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表2。

表2 Hsp70-1+190位點(diǎn)各基因型及等位基因在各組中的分布〔n(%)〕

3 討論

動(dòng)脈硬化性腦梗死是指由于腦部血液供應(yīng)障礙，缺血、缺氧引起的局限性腦組織的缺血性壞死或腦軟化，其發(fā)病原因復(fù)雜。Duggirala等〔3〕認(rèn)為遺傳因素在卒中的發(fā)生中所占比重大約為66% ～74.9%。熱休克蛋白(Hsp)是一個(gè)多基因家族，本身就提示其在漫長的生物進(jìn)化過程中同時(shí)存在著遺傳和變異，主要功能是幫助細(xì)胞適應(yīng)一些應(yīng)激反應(yīng)。目前研究發(fā)現(xiàn)，Hsp70在心臟〔4〕和大腦〔5〕具有細(xì)胞保護(hù)作用;在發(fā)生腦梗死的不同個(gè)體中，淋巴細(xì)胞Hsp70的表達(dá)水平不同，病情的嚴(yán)重程度及預(yù)后也不同〔2〕;也有研究顯示，Hsp70基因多態(tài)性與腦梗死發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等有關(guān)〔6〕。

Hsp70-1基因定位于6p21.3區(qū)MHCⅢ 類分子內(nèi)，其編碼的蛋白質(zhì)呈結(jié)構(gòu)性低水平表達(dá)，可以被熱、腦缺血等誘導(dǎo)。Hsp70-1 基因在-110(A/C)，120(T/C)，190(G/C)和 438(C/T)有多態(tài)性位點(diǎn)，研究較多的是190(G/C)位點(diǎn)。

目前有關(guān)Hsp70-1基因多態(tài)性與疾病關(guān)系研究較多的是自身免疫性疾病和炎性疾病〔7〕。Ridker等〔8〕研究發(fā)現(xiàn)體內(nèi)持續(xù)的低水平的炎性反應(yīng)是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣斑塊和血栓形成的主要因素，而后兩者是腦梗死的主要危險(xiǎn)因素。有研究發(fā)現(xiàn)〔2〕，Hsp70能夠減輕缺血、缺氧對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損害。本研究結(jié)果提示G、C等位基因單獨(dú)對(duì) mRNA的轉(zhuǎn)錄影響不明顯，只有Hsp70-1基因+190位點(diǎn)為GC雜合子時(shí)才降低了mRNA的轉(zhuǎn)錄，從而降低了Hsp70的蛋白水平，使機(jī)體對(duì)腦缺血、缺氧應(yīng)激的耐受性下降，這可能使腦梗死發(fā)生率升高，其中的病理機(jī)制可能是：(1)Hsp70-1基因+190位點(diǎn)位于該基因5'側(cè)翼區(qū)，核苷酸的替換影響了啟動(dòng)子的功能;(2)該位點(diǎn)核苷酸的改變可能影響到mRNA的轉(zhuǎn)錄，從而對(duì)誘導(dǎo)性Hsp70表達(dá)水平產(chǎn)生影響。本研究結(jié)果與Liu等〔9〕人研究深圳市漢族Hsp70-1基因+190 G/C多態(tài)性與缺血性腦卒中相關(guān)的結(jié)果相似;但與Zee等〔10〕研究結(jié)果不一致，其原因可能是ZEE研究的對(duì)象都是來自高加索人群(白種人)，可能存在基因與基因，基因與環(huán)境的交互作用。

高血壓是腦梗死最重要的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。但本研究結(jié)果提示Hsp70-1+190位點(diǎn)基因多態(tài)性可能是腦梗死除高血壓之外的比較特異性的危險(xiǎn)因素，針對(duì)無高血壓病史的患者，攜帶Hsp70-1+190位點(diǎn)CG基因型的個(gè)體要比其他兩種基因型患腦梗死的概率高。而針對(duì)腦梗死并高血壓組，該位點(diǎn)基因多態(tài)性與腦梗死不合并高血壓組有差異，與單純高血壓及健康組均無差異，說明Hsp70-1+190位點(diǎn)基因多態(tài)性對(duì)高血壓患者發(fā)生腦梗死的幾率無明顯影響。

總之，通過本研究我們發(fā)現(xiàn)Hsp70基因多態(tài)性在腦梗死的發(fā)生發(fā)展中具有重要價(jià)值，其中Hsp70-1+190位點(diǎn)GC基因型在腦梗死患者特別是腦梗死不合并高血壓患者中明顯升高，因此，檢測腦梗死患者Hsp70-1+190位點(diǎn)基因型，將可能作為預(yù)測腦梗死發(fā)生的一項(xiàng)重要指標(biāo)，并為進(jìn)一步探索腦梗死的發(fā)病機(jī)制提供了一條新途徑。

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R587.1

A

1005-9202(2012)17-3628-04;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.17.005

云南省科技廳-昆明醫(yī)學(xué)院應(yīng)用基礎(chǔ)研究聯(lián)合專項(xiàng)基金資助課題(2007C0041R);2007年昆明市衛(wèi)生局課題

金醒昉(1962-)，女，主任醫(yī)師，碩士，碩士生導(dǎo)師，主要從事老年病學(xué)研究。

魏云鴻(1981-)，女，碩士，住院醫(yī)師，主要從事老年病學(xué)研究。

〔2011-11-03收稿 2012-02-12修回〕

(編輯 曹夢園)