黃惠蓮

鉤藤為多源中藥材，藥典收載的品種有:茜草科植物鉤藤 Uncaria rhynch0phylla(Miq.)Jacks.、大葉鉤藤 Uncariamacrophylla Wall.、毛鉤藤 Uncaria hirsuta Havil.、華鉤藤 Uncaria sinensis(Oliv.)Havil.或無柄果鉤藤 Uncaria sessilifructus Roxb.的干燥帶鉤莖枝。秋、冬二季采收，去葉，切段，曬干［1，2］。鉤藤藥材是我公司產(chǎn)品小兒七星茶顆粒的主要原料，它具有清熱平肝，息風(fēng)定驚的作用;主要用于頭暈?zāi)垦?、風(fēng)熱頭痛、小兒煩熱驚厥等癥。是中醫(yī)的兒科要藥。藥用部分是鉤藤植物花序柄變成的鉤狀物以及相連的一小部分枝條。莖枝呈圓柱形或類方柱形，長(zhǎng)2～3 cm，直徑0.2～0.5 cm。表面紅棕色至紫紅色者具細(xì)縱紋，光滑無毛，黃綠色至灰褐色者有時(shí)可見白色點(diǎn)狀皮孔，被黃褐色柔毛。多數(shù)枝節(jié)上對(duì)生兩個(gè)向下彎曲的鉤(不育花序梗)，或僅一側(cè)有鉤，另一側(cè)為凸起的疤痕;鉤略扁或稍圓，先端細(xì)尖，基部較闊;鉤基部的枝上可見葉柄脫落后的窩點(diǎn)狀痕跡和環(huán)狀的托葉痕。質(zhì)堅(jiān)韌，斷面黃棕色，皮部纖維性，髓部黃白色或中空。無臭，味淡［3］。李時(shí)珍稱“古方多用皮，后世多用鉤，取其力銳耳”?？梢娭ζさ男ЯΣ患般^，鉤多枝少則效強(qiáng)，鉤少枝多則效弱?，F(xiàn)時(shí)售的鉤藤，多為鉤與枝混雜，未見出售純鉤，只是帶鉤率的差異。又據(jù)中國藥學(xué)大辭典載，純用嫩鉤，效力要大十倍。而鉤藤一般多以藥材粉末或煎煮法提取物入藥。故本實(shí)驗(yàn)以藥材粉末顯微鑒別和煎煮法提取物中異鉤藤堿的含量來判斷鉤藤的帶鉤率，從而可根據(jù)不同的處方用藥需求來控制鉤藤的質(zhì)量。該方法的樣品提取簡(jiǎn)單、實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確。

1 儀器、試藥與藥品

顯微鏡:系統(tǒng)生物顯微鏡;型號(hào):OLYMPUS BX-41;放大倍數(shù):10×40;高效液相色譜儀:Agilent1100;檢測(cè)器:DAD;HPLC色譜柱:迪馬 ODS-C18(250 mm×4.6 mm，5 m);電子天平:Sartorius-CPA225D;甲醇:色譜純，Merck KGaA;水為超純水;其余試劑均為分析純;異鉤藤堿(批號(hào):111927-201001中國藥品生物制品檢定所);不同帶鉤率的鉤藤藥材及提取物(廣州王老吉藥業(yè)股份有限公司提供)。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 鉤藤藥材粉末顯微鑒別 樣品均為不同帶鉤率的藥材樣品，顯微特征為:本品粉末淡紅棕色至淺黃棕色。韌皮纖維:很多，大多成束，也有單個(gè)散離，淡黃色或無色，較長(zhǎng)，壁厚，也有較薄的，非木化或微木化，孔溝不明顯，胞腔線性，少數(shù)較寬，有的含黃綠色物。韌型纖維:較多，大多成束，少數(shù)單個(gè)散離。甚長(zhǎng)，壁稍厚，木化，斜紋孔明顯。表皮細(xì)胞:棕黃色。表面觀呈類多角形或稍延長(zhǎng)，含有油滴狀物，斷面觀可見較厚的角質(zhì)層。木化薄壁細(xì)胞:成片，包括木射線、髓部及木薄壁細(xì)胞。呈類方形、類圓形、類多角形或細(xì)長(zhǎng)方形，紋孔較多，孔溝大多明顯［4］。(藥材顯微特征圖示:1～4)

圖1 韌皮纖維

圖2 韌型纖維

圖3 皮部薄壁細(xì)胞

圖4 木化薄壁細(xì)胞

2.2 鉤藤提取物中異鉤藤堿含量測(cè)定

2.2.1 波長(zhǎng)選擇 采用Agilent高效液相色譜儀，DAD檢測(cè)器，對(duì)異鉤藤堿對(duì)照品溶液，在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，在254 nm波長(zhǎng)處有較強(qiáng)吸收，選定254 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)［5］。見圖 5。

圖5 異鉤藤堿對(duì)照品光譜圖

2.2.2 色譜條件及系統(tǒng)適用性 以十八烷基硅烷健合硅膠為填充劑;甲醇-水(含0.01 mol/三乙胺，冰醋酸調(diào) pH7.5)(53∶47)為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm;理論板數(shù)按異鉤藤堿峰計(jì)算應(yīng)不低于2000。

2.2.3 不同帶鉤率的供試品溶液的配制 取樣品2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10 ml，稱定重量，超聲提取30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，即得。

圖6 異鉤藤堿對(duì)照品溶液色譜圖

圖7 鉤藤提取物溶液色譜圖

2.2.4 對(duì)照品溶液的配制 取異鉤藤堿對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml含8 μg的溶液，搖勻，即得。

2.2.5 專屬性考察 將異鉤藤堿對(duì)照品溶液、供試品溶液，在按制定的色譜條件下，注入液相色譜儀中，得高效液相色譜圖。結(jié)果見圖6～7。

2.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 配制異鉤藤堿對(duì)照品溶液，分別為每毫升各含 1.0943 μg，2.1886 μg，4.3772 μg，8.7744 μg，17.5088 μg，35.0175 μg，70.0350 μg，進(jìn)樣量為 10 μl，按制定的色譜條件測(cè)定各峰面積。以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，各對(duì)照品的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程:異鉤藤堿:y=19.916x-2.2777，R2=0.9997;說明異鉤藤堿在1.0943～70.0350 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 取異鉤藤堿對(duì)照品溶液10 μl，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積，并計(jì)算得異鉤藤堿RSD=0.58%。說明該方法的精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取帶鉤率為100%的鉤藤提取物供試品溶液，精密吸取10 l，注入高效液相色譜儀中，分別在0、2、4、8、12、24 h 測(cè)定，計(jì)算，得異鉤藤堿:RSD=0.56% 。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 分別鉤率為100%的鉤藤提取物供試品溶液6份，依法測(cè)定，計(jì)算，異鉤藤堿RSD為1.83%。說明該方法重復(fù)性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗(yàn) 分別精密稱取6份已知含量的鉤藤提取物各2.0 g，置具塞錐形瓶中，再分別精密加入一定量的異鉤藤堿對(duì)照品溶液，按制定的方法及色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果表1。樣品測(cè)定:分別精密稱定不同帶鉤率的鉤藤提取物，按制定的提取方法及色譜條件進(jìn)行計(jì)算與分析，結(jié)果見表2。

表1 鉤藤提取物加樣回收率試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

表2 樣品測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 從不同顯微特征，可區(qū)分不同帶鉤率的鉤藤藥材:藥材中帶鉤越多韌皮纖維與韌型纖維越多，隨著鉤的減少韌皮纖維與韌型纖維也減少。

3.2 鉤藤主要含吲哚類生物堿、三萜類成分和糖苷類物質(zhì)，其中生物堿是主要有效成分，主要有異鉤藤堿、鉤藤堿、柯諾辛堿、柯諾辛堿B等，以異鉤藤堿的清熱平肝，息風(fēng)定驚的作用最為顯著。本實(shí)驗(yàn)以不同帶鉤率的鉤藤提取物中異鉤藤堿為主要成分測(cè)定其含量，其提取方法為水煎煮二次，每次2小時(shí)，合并煎液，濾過，濾液濃縮成相對(duì)密度為1.3～1.4(62℃ ～72℃)的稠膏作為樣品檢驗(yàn)。

3.3 本品曾用濃氨溶液1 ml，濕潤(rùn)再加二氯甲烷10 ml超聲20 min，與甲醇10 ml、超聲提取30 min，作為對(duì)比測(cè)定含量，結(jié)果用甲醇10 ml、超聲提取所得的異鉤藤堿含量最高。而且?guī)с^率越高含量也越高，特別是新鮮鉤藤含量最高。

3.4 顯微鑒別法可對(duì)藥材粉末中的不同帶鉤率進(jìn)行區(qū)分，高效液相色譜法可對(duì)提取物中的不同帶鉤率進(jìn)行區(qū)分，而且它們的特征性較強(qiáng)，專屬性及重現(xiàn)性好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，該方法可用于鉤藤的帶鉤率與質(zhì)量的關(guān)系的分析。

［1］葉華谷，彭少麟.廣東植物多樣性編目.廣東世界圖書出版公司，2006:394-395.

［2］劉佳，富志軍.鉤藤的研究概況;海峽藥學(xué)，2006，18(5):90-93.

［3］國家藥典委員會(huì).中國藥典(2010年版，一部).北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2010.240附錄ⅥD

［4］徐國均.中藥材粉末顯微鑒定.人民衛(wèi)生出版社，1986:678-679.

［5］劉明，湯建林，胡嵐嵐，等.中藥鉤藤中鉤藤堿含量的測(cè)定，第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，32(14):1539-1541.