曹 婧 侯晨輝

鄭州鐵路職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南鄭州 450052

中藥靛玉紅對膀胱癌細(xì)胞株的生長抑制作用觀察

曹 婧 侯晨輝

鄭州鐵路職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南鄭州 450052

目的探討靛玉紅對膀胱癌細(xì)胞株的生長抑制作用。方法體外持續(xù)傳代培養(yǎng)已加有不同濃度靛玉紅的膀胱癌細(xì)胞株30d，記錄各組各代細(xì)胞的增殖周期；MTT法測定不同濃度不同作用時間的靛玉紅對細(xì)胞株的生長抑制作用。結(jié)果不同濃度的靛玉紅均能抑制細(xì)胞株生長，并呈明顯的量效關(guān)系和時間依賴性。結(jié)論靛玉紅能夠明顯抑制膀胱癌細(xì)胞株增殖，且具有量效關(guān)系和時間依賴性。

靛玉紅；膀胱癌；生長抑制

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤[1]，我國膀胱癌發(fā)病率居泌尿系統(tǒng)腫瘤第一位，其中90%以上為膀胱移行細(xì)胞癌。目前臨床上對膀胱癌采用的主要治療方法是手術(shù)切除，術(shù)后化療，必要時放療。但膀胱癌總體來說復(fù)發(fā)率較高。目前臨床工作者和研究者均認(rèn)為，從中藥中尋找新的抗腫瘤藥物已成為發(fā)展方向。靛玉紅是我國創(chuàng)制的治療慢性粒細(xì)胞白血病的有效藥物，它是治療慢性粒細(xì)胞白血病的有效成分，由傳統(tǒng)中藥青黛中提取。其抗腫瘤作用原理主要為抑制DNA聚合酶，影響DNA的聚合過程，從而使DNA合成受抑制。本實(shí)驗(yàn)將不同濃度的中藥靛玉紅作用于膀胱癌細(xì)胞株，觀察其對膀胱癌細(xì)胞株的生長抑制作用，并進(jìn)一步觀察其是否具有量效關(guān)系和時間依賴性。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

RPMI1640培養(yǎng)液、二甲基亞砜（DMSO）、甲基四唑藍(lán)、胰蛋白酶、靛玉紅粉劑(用前靛玉紅需經(jīng)DMSO溶解，需用不同濃度時，加RPMI1640培養(yǎng)液稀釋)、胎牛血清。膀胱癌細(xì)胞株。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)組：靛玉紅在培養(yǎng)液中終濃度分別為1μmol/L、5μmol/L、10 μmol/L，傳代后即加加入含有不同濃度藥物的培養(yǎng)液；對照組：藥物終濃度為0，持續(xù)傳代培養(yǎng)。

1.3 按常規(guī)方法細(xì)胞培養(yǎng)膀胱癌細(xì)胞株

體外培養(yǎng)，在37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)：RPMI1640培養(yǎng)液中含有鏈霉素、青霉素100u/mL、10%胎牛血清及靛玉紅，其濃度分別為 0、1、5、10 μmol/L，持續(xù)傳代培養(yǎng)一個月（30d），記錄每組中每一代細(xì)胞的增殖周期。

1.4 細(xì)胞生長抑制試驗(yàn)（MTT試驗(yàn)）

以0.5%的胰蛋白酶消化將處于對數(shù)生長期、未加藥的膀胱癌細(xì)胞，用RPMI1640培養(yǎng)液（內(nèi)含鏈霉素、10%胎牛血清及青霉素100u/ml）制成細(xì)胞數(shù)為2×104的細(xì)胞懸液并接種于96孔培養(yǎng)板，按試驗(yàn)要求在培養(yǎng)24h后，分別在細(xì)胞中加入藥物靛玉紅。終濃度分別為 0、1μmol/L、5 μmol/L 、10 μmol/L，每組 5 復(fù)孔，并設(shè)置空白對照組。 置于 37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng) 12、24、48h、72h后取出，加入20μL5mg/mL的MTT在每孔內(nèi)，然后作用4h于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中。吸取各孔內(nèi)上清棄去，每孔加入DMSO150 μL，振蕩10min。最后在波長570nm下用BIO-RAD Model 680酶標(biāo)儀測定各組的吸光度A值。細(xì)胞生長抑制率（%）=（對照組吸光度A值-實(shí)驗(yàn)組吸光度A值）/對照組吸光度A值×100%。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

統(tǒng)計學(xué)軟件采用SPSS 13.0進(jìn)行處理，進(jìn)行單因素方差分析，組間比較用t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以（±s）表示，P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖周期的變化

在細(xì)胞培養(yǎng)的一個月內(nèi)，對照組傳代并收集了9代細(xì)胞，靛玉紅濃度為 1μmol/L組共8代細(xì)胞、5 μmol/L組共 5代細(xì)胞、10 μmol/L組則只傳代并收集了2代細(xì)胞。在同一組內(nèi)部，后一代的細(xì)胞比前代細(xì)胞達(dá)到傳代標(biāo)準(zhǔn)所需的時間也逐漸延長。這說明隨著靛玉紅濃度的增加，作用時間的延長，膀胱癌細(xì)胞株的增殖周期也明顯延長。見圖1。

圖1 靛玉紅對Scaber細(xì)胞增殖周期的影響

2.2 細(xì)胞生長抑制試驗(yàn)（MTT試驗(yàn)）

活細(xì)胞特別是增殖細(xì)胞可將外源性MTT代謝成難溶的紫藍(lán)色沉淀，其數(shù)量與增殖程度成正比，而死的細(xì)胞則不能如此。二甲基亞砜（DMSO）能夠溶解細(xì)胞中的紫藍(lán)色沉淀，用酶標(biāo)儀測定各組的吸光度A值，可以間接反映活細(xì)胞的數(shù)量。細(xì)胞生長抑制率（%）=（對照組吸光度A值-實(shí)驗(yàn)組吸光度A值）/對照組吸光度A值×100%。結(jié)果說明隨著靛玉紅濃度增加、作用時間延長，膀胱癌細(xì)胞株的生長抑制率也明顯增加。見表1。

表1 靛玉紅對膀胱癌Scaber細(xì)胞株的生長抑制作用（±s）

表1 靛玉紅對膀胱癌Scaber細(xì)胞株的生長抑制作用（±s）

各組間生長抑制作用有差異（P＜0.05）

藥物濃度（μmol∕L）細(xì)胞生長抑制率（%）12h 24h 48h 72h 151 0 6.72±1.84 10.79±2.11 16.51±1.16 10.27±3.94 15.58±1.27 23.55±2.73 15.77±2.71 27.82±3.07 33.63±2.81 23.40±2.96 31.09±4.39 41.96±4.77

3 討論

泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤中，膀胱癌是最常見的。由于其術(shù)后輔助治療療效不甚理想，目前各國研究者都在尋找新的、有效的抗膀胱癌細(xì)胞增殖的藥物。中藥來源天然，毒副作用較少，從中藥中尋找新的抗腫瘤藥物已成為許多研究者的共識。中藥靛玉紅是傳統(tǒng)藥物，由我國創(chuàng)制，主要用于治療白血病，尤其對慢性粒細(xì)胞白血病有明顯療效。其主要優(yōu)點(diǎn)在于中藥毒副作用較小，且無明顯骨髓抑制作用。在縮小脾臟和降低白細(xì)胞方面較白消安好。其作用原理主要為抑制DNA聚合酶，影響DNA聚合過程，從而使DNA合成受抑制。除此之外，能夠提高機(jī)體免疫功能也可能是其抗癌機(jī)制之一。

近年來的研究顯示，靛玉紅抑制腫瘤生長及腫瘤細(xì)胞的DNA合成是通過抑制腫瘤生長所必需的蛋白激酶發(fā)揮作用的，包括CDKS、Src等。其主要通過以下三種途徑抑制腫瘤細(xì)胞生長：①靛玉紅及其衍生物競爭性拮抗CDK的ATP結(jié)合位點(diǎn)，阻斷細(xì)胞周期。②靛玉紅及其衍生物抑制Src激酶，阻斷Stat3信號傳導(dǎo)通路，致使由Stat3磷酸化激活的抗細(xì)胞程序性死亡的轉(zhuǎn)錄蛋白增加的過程受到抑制，從而使癌細(xì)胞發(fā)生程序性細(xì)胞死亡。③靛玉紅及其衍生物抑制核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，抑制核苷酸的吸收，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。除此之外，靛玉紅還有可能通過抑制成纖維細(xì)胞生長因子受體（FGFR）來抑制腫瘤細(xì)胞生長[2]。目前靛玉紅主要用于對慢性粒細(xì)胞白血病的治療，對實(shí)體瘤細(xì)胞的抑制作用研究進(jìn)行得較少。

本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果顯示，在一定的時間內(nèi)（細(xì)胞培養(yǎng)時間為30d），各組傳代次數(shù)逐漸減少。對照組（不加藥）共傳代并收集了 9代細(xì)胞，1μmol/L組共 8代細(xì)胞，5 μmol/L組共 5代細(xì)胞，而靛玉紅濃度最大組（10 μmol/L組）只有兩代細(xì)胞；同一實(shí)驗(yàn)組內(nèi)，增殖周期隨作用時間增加也逐漸延長。對照組穩(wěn)定在3～3.5d傳代一次；1μmol/L組（A組）最初3d傳代一次，至第八代細(xì)胞時漸增至近 5d；5 μmol/L組（B組）由第一代細(xì)胞的經(jīng) 4d傳代增至第五代細(xì)胞的8d；而10 μmol/L組（C組）的細(xì)胞第一次傳代歷經(jīng)8d，第二次12d，其后直至規(guī)定的細(xì)胞培養(yǎng)時間結(jié)束（共 30d），也未達(dá)到傳代標(biāo)準(zhǔn)，只收集到兩代細(xì)胞。MTT結(jié)果顯示，靛玉紅作用于Scaber細(xì)胞株同一時相如24h時，當(dāng)藥物濃度由1μmol/L上升至 10 μmol/L時， 細(xì)胞生長抑制率由 （10.27±3.94）%上升至（23.55±2.73）%； 而藥物濃度相同如 5 μmol/L時， 分別作用 12、24、48、72h， 細(xì)胞生長抑制率則為（10.79±2.11）% 、（15.58±1.27）%、（27.82±3.07）%、（31.09±4.39）%。 組間差異有顯著性（P＜0.05）。這表明，靛玉紅的濃度越大，作用時間越長，其對細(xì)胞增殖抑制的效果就越顯著。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，靛玉紅具有體外抗膀胱癌作用，且具有時間和劑量依賴性。其對膀胱癌的抑制作用機(jī)制，有待進(jìn)一步研究。

[1]周際昌.實(shí)用腫瘤內(nèi)科學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,2005：351-352

[2]Zhen Y,Srensen V,Suo Z ，et al.Oncogene,2007,26：6372-6385.

R97

A

1672-5654（2012）07（a）-0168-02

2012-06-15）