鞠文博 曲智威 周 艷 (北華大學組胚教研室，吉林 吉林 3203)

酒精中毒可導致機體很多器官發(fā)生病變，亦可以導致嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，以四肢及舌震顫、癲樣發(fā)作、共濟失調(diào)居多〔1〕。長期大量飲酒可帶來大腦結構持久性或可逆性改變，有人對酒精成癮者尸檢發(fā)現(xiàn)，有半數(shù)以上的病人合并有腦萎縮和神經(jīng)細胞變性、脫髓鞘及膠質(zhì)細胞增生〔2〕。因此，酗酒和酒精中毒對大腦的損害成為世界性的研究課題〔3〕。葛根素是從豆科植物野葛的干燥根中提取的一種化學成分，其化學名為8-β-D葡萄吡喃糖-4，7二羥基異黃酮〔4〕。藥理實驗研究表明，葛根素具有降低血壓、減慢心率、降低心肌耗氧量〔5〕;對心肌的保護作用，對腎的保護作用，抗氧化作用，抗缺血再灌注損傷的作用〔6〕;抗酒精中樞抑制作用，降血糖，防治糖尿病及其并發(fā)癥，改善血液流變學指標，改善微循環(huán)和抗血小板聚集等作用〔7〕。本課題組選用了葛根素作為對抗酒精的中藥進行試驗研究，從中醫(yī)中藥角度治療酒精性腦病提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料 30只Wistar大鼠，雄性，體重 (180±20)g(由吉林大學的實驗動物所提供)，50%葡萄糖，葛根素，酒精，顯微攝像系統(tǒng) (Olympus)，離心機，組織勻漿機;腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯(lián)免疫試劑盒 (由深圳晶美生物工程有限公司提供);全自動酶標儀 (美國BIO-TEK 800型);鱟試劑盒 (北京中山生物技術有限公司)。兔抗鼠環(huán)氧化酶-2(COX-2)多克隆抗體 (美國Cayman公司);小鼠抗大鼠β-肌動蛋白 (β-actin)單克隆抗體 (美國Sigma公司);生物素標記的羊抗兔二抗 (英國KPL公司)，辣根過氧化物酶標記羊抗兔及羊抗鼠二抗、增強化學發(fā)光劑 (ECL，北京中山生物技術有限公司)，硝酸纖維素膜 (北京鼎國生物技術有限責任公司)，其他試劑均為分析純。

1.2 方法 動物分組：30只Wistar大鼠，隨機分為3組，每組10只。對照組用50%葡萄糖20 ml·kg－1·d－1灌胃，模型組用40%酒精按 8 g·kg－1·d－1灌胃，葛根素組：葛根素水溶液10 mg·kg－1·d－1灌胃給藥5 min后，酒精灌胃，酒精量同模型組。給藥30 d造模結束后，采用巴比妥鈉麻醉、腹主動脈采血后處死大鼠。

1.3 內(nèi)皮素(ET)檢測 用偶氮顯色法定量檢測和葛根素組大鼠血漿中的ET水平(依據(jù)試劑盒說明檢測)。

1.4 腦組織TNF-α檢測 抽血后，斷頸處死各組大鼠，在無菌條件下，剖開顱腦，切取大腦組織，生理鹽水洗凈備用。取一小塊大腦組織稱取濕重后，按W∶V為1∶5的比例加入生理鹽水，用組織勻漿機攪拌成腦勻漿。將勻漿置于離心管中，以4 000 r/min離心20 min，取上清液，用ELISA法檢測各組腦組織勻漿中TNF-α的含量(依據(jù)試劑盒說明檢測)。

1.5 COX-2表達檢測 使用Western印跡方法檢測腦組織COX-2表達。取冷凍的腦組織稱重后按1∶10比例用三去污蛋白裂解液裂解，10 000 r/min離心5 min，2次，取上清。用考馬斯亮藍(G250)測定蛋白含量。以每樣品總蛋白為150 μg上樣，用不連續(xù)10%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干轉蛋白至硝酸纖維素膜：10%脫脂奶粉封閉;一抗4℃過夜;Ris緩沖液(TBS)洗膜;辣根過氧化物酶標記二抗37℃2 h，TBS洗膜，ECL作用后X膠片曝光，經(jīng)顯影、定影等處理后觀察結果。并用Bandscan軟件作灰度掃描分析，用COX-2與內(nèi)參β-actin灰度值比值表示各樣本COX-2表達強度，并作統(tǒng)計學處理。

1.6 統(tǒng)計學方法 應用SPSS13.5統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)資料以s表示，采用T檢驗分析

2 結果

2.1 一般情況 對照組被毛光滑，精神狀態(tài)好，食欲佳，體重增加。模型組的大鼠精神萎靡，活動減少，食欲減退，消瘦，皮毛無光澤，有脫毛現(xiàn)象，體重較前有所下降。葛根素組的大鼠精神、食欲及活動和對照組無明顯差異。

2.2 血漿中ET的含量 模型組血漿中ET含量明顯高于對照組和葛根素組，葛根素組和對照組無差異。見表1。

2.3 腦組織勻漿中TNF-α含量 模型組的腦組織勻漿中TNF-α的含量明顯高于對照組，葛根素組和對照組差異不顯著。見表1。

表1 葛根素組和對照組及模型組的大鼠血漿中ET含量和腦組織勻漿中TNF-α含量比較(s)

表1 葛根素組和對照組及模型組的大鼠血漿中ET含量和腦組織勻漿中TNF-α含量比較(s)

與模型組比較：1)P＜0.05

組別 n ET(Eu/ml)TNF-α(ng/g)對照組 10 0.302±0.078 10.73±0.361)葛根素組 10 0.503±0.128 12.73±0.381)模型組 10 0.812±0.126 16.68±0.432)

2.4 腦組織COX-2表達 對照組呈弱表達，模型組顯著高表達，與對照組比較差別顯著(P＜0.01)。葛根素組COX-2表達下調(diào)，與模型組相比有明顯下調(diào)(P＜0.01)。經(jīng)計算機Bandscan軟件分析其灰度值，COX-2灰度值與β-actin灰度值比值為：對照組為0.196±0.079，模型組為0.421±0.033，葛根素組為0.281±0.046。見圖1。

圖1 腦組織COX-2表達結果

3 討論

長期大量飲酒帶來的損傷是廣泛的，包括消化系統(tǒng)的潰瘍、嚴重的肝臟的損害、腎臟的損駭以及循環(huán)系統(tǒng)的損害等多器官、多系統(tǒng)的損害，更加嚴重的是神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，表現(xiàn)為一系列思維及行為釋放狀態(tài)，如患者理智障礙、易沖動、共濟失調(diào)、語無倫次、嘔吐、嗜睡等，因大腦急性缺氧，重者可引起癲癇、抽搐甚至死亡。酒精性肝損傷與ET血癥具有相關性，原因可能是飲酒后，一方面造成腸道菌群失調(diào)，革蘭陰性菌產(chǎn)生增多，腸源性ET增多;另一方面，酒精可致腸壁通透性增加，進而ET吸收入血增加，導致腸源性ET血癥;而ET可直接引起血腦屏障通透性增加，誘使腦微血管出現(xiàn)凝血功能紊亂，造成腦組織缺氧，以及誘導腦組織中TNF-α的升高，從而使腦組織發(fā)生炎性水腫〔8〕。ET致細胞因子在大鼠腦水腫中表達增加已有研究證實〔9〕。研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α是使血管內(nèi)皮細胞黏附分子表達上調(diào)的重要細胞因子，能夠引起白細胞趨化，破壞血腦屏障，興奮氨基酸受體，并刺激膠質(zhì)細胞產(chǎn)生大量的NO，從而造成腦水腫〔10〕。

本實驗結果說明葛根素能夠對抗酒精對大鼠腦組織損傷的影響，其機制可能是在急性酒精中毒的情況下，葛根素可以改善血液循環(huán)，增加組織氧供，有利于酒精的氧化代謝;通過擴張血管，改善腎小管的痙攣狀態(tài)而增加腎血流量，尿量增加，排泄增強，從而降低血液中乙醇水平，減少腸道對酒精的吸收，從而減少血液中含ET量的增高，減少腦組織炎性因子TNF-α的增加，從而減少腦組織發(fā)生炎性水腫，降低對腦組織的損傷。

COX是前列腺素類(PGs)物質(zhì)合成過程中的一個限速酶。COX-2亞型在正常組織中不表達或低表達，但在炎癥、腫瘤等病理狀態(tài)下，可受眾多因素的刺激，其表達明顯升高〔11〕。本實驗結果表明：葛根素組COX-2表達與模型組相比有明顯下調(diào)。

本項研究結果證實，葛根素具有減少機體對酒精的吸收，減輕酒精對腦組織的損傷作用，其作用機制主要是減少ET的吸收，從而減少腦組織中TNF-α及COX-2含量，減輕了對腦組織的損傷。

1 馬毓芬.141例慢性酒精中毒患者臨床資料分析〔J〕.地方病通報，2007;22(4)：100.

2 趙大志.慢性酒精中毒31例臨床分析〔J〕.中華醫(yī)學研究雜志，2006;6(8)：908-9.

3 朱 江，鄔于川.大鼠酒精性腦損傷組織中TNF-α的表達〔J〕.四川醫(yī)學，2006;2(2)：117-8.

4 Seitz HK，Stickel F.Alcoholic liver disease in the elderly〔J〕.Clin Geriatr Med，2007;3723(4)：905-21.

5 Tan Y，Liu M，Wu B.Puerarin for acute ischaemic stroke〔J〕.Cochrane Database Syst Rev，2008;23(1)：4955.

6 劉 瑞，孟 芳，白 懷，等.槲皮素、蘆丁及葛根素抑制LDL氧化修飾作用的研究〔J〕.中國中藥雜志，2007;32(19)：2058-62.

7 Hwang YP，Choi CY，Chung YC，et al.Protective effects of puerarin on carbon tetrachloride-induced hepatotoxicity〔J〕.Arch Pharm Res，2007;30(10)：1309-17.

8 蔣業(yè)貴，李兆中.酒精性肝病發(fā)病機制的研究進展〔J〕.胃腸病學和肝病學雜志，2003;12(5)：484-6.

9 王懷立，高東培，蘆軍萍.TNF-α、IL-8在脂多糖致大鼠腦水腫中的表達〔J〕.免疫學雜志，2002;18(6)：440-2.

10 Samaka RM，Abdou AG，Abd El-Wahed MM，et al.Cyclooxygenase-2 expression in chronic gastritis and gastric carcinoma，correlation with prognostic parameters〔J〕.J Egypt Natl Canc Inst，2006;18(4)：363-74.

11 Harada N，Okajima K，Uchiba M，et al.Antithrombin reduces ischemia/reperfusion-induced liver injury in rats by activation of cyclooxygenase-1〔J〕.Thromb Haemost，2004;92(3)：550-8.