郭威早 佟 倩 (航天中心醫(yī)院高干二科，北京 00049)

冠心病是我國(guó)居民死因構(gòu)成中上升最快的疾病〔1〕。遺傳易感性是冠心病發(fā)病的重要因素，然而目前對(duì)冠心病的致病基因及其作用機(jī)制仍然沒(méi)有定論〔2〕。在冠心病眾多的候選基因中，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin converting enzyme，ACE)是被研究得最為深入和廣泛的發(fā)病相關(guān)基因之一〔3〕。但是，關(guān)于ACE的研究結(jié)果在不同的人群中不盡相同。既往的研究也提示基因-基因以及基因-環(huán)境相互作用是一個(gè)值得深入的研究方向〔4〕。微小RNA(microRNA，miRNA)是生物體中內(nèi)源性的由基因表達(dá)產(chǎn)生的短鏈RNA分子，長(zhǎng)度為22個(gè)核苷酸左右，通過(guò)與相關(guān)的信使RNA(mRNA)結(jié)合抑制其翻譯或誘發(fā)其降解〔5〕。miRNA通過(guò)基因調(diào)控，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化以及對(duì)環(huán)境的適應(yīng)中發(fā)揮著非常重要的作用〔6〕。如果將miRNA機(jī)制納入ACE的基因調(diào)控，則可以合理地建立基因與環(huán)境的相互作用，更好地符合冠心病的宏觀模型?；谏鲜霰尘埃狙芯繉?duì)ACE的miRNA調(diào)控機(jī)制進(jìn)行探討和分析。

1 材料與方法

1.1 調(diào)節(jié)ACE基因的miRNA預(yù)測(cè) 根據(jù)“種”序列匹配原理，利用美國(guó)麻省理工學(xué)院(MIT)TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)(2011年11月第6版)進(jìn)行，對(duì)人ACE基因1 014 bp(根據(jù)NCBI編號(hào)為NM_152830參考序列)的3'-UTR進(jìn)行了候選miRNA的預(yù)測(cè)。具體操作方法根據(jù)該數(shù)據(jù)庫(kù)的在線操作指南進(jìn)行。

1.2 大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng) 大鼠心肌細(xì)胞株H9c2(2-1)購(gòu)自美國(guó)ATCC公司，在Forma-3110型二氧化碳溫箱中，參照本課題組此前報(bào)道的方法〔7〕進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)基及胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。基本步驟：采用DMEM培養(yǎng)基加10%胎牛血清，在5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)。每輪培養(yǎng)3 d。階段培養(yǎng)結(jié)束后，采用0.25% 胰蛋白酶合并0.53 mmol/L EDTA溶液處理10 min，細(xì)胞脫壁收集后按1∶4的比例分盤(pán)繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 miRNA的增強(qiáng)和抑制 增強(qiáng)劑和抑制劑均從美國(guó)ABI公司購(gòu)買(mǎi)。miR-27a/27b增強(qiáng)劑為合成的雙鏈RNA分子;miR-27a/27b抑制劑為化學(xué)修飾的單鏈核酸，可以特異地結(jié)合miR-27a/27b而產(chǎn)生抑制效應(yīng)。此外，以Pre-miR(增強(qiáng))/Anti-miR(抑制)陰性對(duì)照1號(hào)作為陰性對(duì)照。為了將miR-27a/27b增強(qiáng)劑、抑制劑及陰性對(duì)照導(dǎo)入培養(yǎng)的H9c2(2-1)大鼠心肌細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)采用美國(guó)Neuromics公司iFect轉(zhuǎn)染試劑盒，具體操作按照該試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。每種miRNA轉(zhuǎn)染劑量在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，按有效最低劑量原則選擇為20 nmol/L。細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后狀態(tài)繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.4 蛋白免疫印跡雜交 參照文獻(xiàn)報(bào)道〔7〕方法進(jìn)行，作了少許簡(jiǎn)化和修改。具體步驟：將收集的約106個(gè)心肌細(xì)胞在1 ml冰冷的裂解緩沖液中重懸，細(xì)胞裂解緩沖液購(gòu)自北京博大萬(wàn)興科技有限公司。勻漿后通過(guò)Virtis超聲細(xì)胞粉碎儀進(jìn)行超聲剪切(設(shè)置2.0，處理1 s×10次);然后，以Eppendorf-5417R離心機(jī)于4℃，12 000 r/min，離心5 min去除不溶性沉渣。蛋白濃度測(cè)定采用Pierce公司BCA蛋白試劑盒進(jìn)行。等量的蛋白加入到8%～16%SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離，然后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。硝酸纖維素膜上的非特異結(jié)合通過(guò)以下雜交液屏蔽。雜交液包括Tris緩沖鹽水，0.1%吐溫-20，5%脫脂牛奶。兔抗人ACE抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz生物技術(shù)公司，該抗體除可用于人源性ACE蛋白的檢測(cè)，亦可以用于大鼠和小鼠ACE蛋白的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)中采用1∶200的比例稀釋。次級(jí)抗體為辣根過(guò)氧化物酶耦聯(lián)的抗兔抗體，購(gòu)自北京翰譜生物醫(yī)藥研究所。免疫復(fù)合物用Amersham ECL加強(qiáng)型試劑盒檢測(cè)。免疫印跡的定量分析采用Syngene凝膠建檔及分析系統(tǒng)進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 一元ANOVA采用SPSS11.5軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 調(diào)節(jié)人ACE基因的miRNA預(yù)測(cè)結(jié)果 共有218個(gè)miRNA具有和人類(lèi)ACE基因3'-UTR結(jié)合并調(diào)節(jié)該基因的理論可能性。在ACE基因與心血管疾病關(guān)系的研究中，許多疾病模型均建立于動(dòng)物如大鼠〔8〕，這種研究的前提就是大鼠和人在ACE基因調(diào)控方面具有基本的一致性。依照這個(gè)前提，本研究對(duì)miRNA的種系恒定性(conservation)進(jìn)行了進(jìn)一步的分析，采用兩個(gè)種系恒定性的標(biāo)準(zhǔn)，即miRNA自身的種系恒定性以及在ACE上所預(yù)測(cè)的結(jié)合位點(diǎn)的種系恒定性，兩種恒定性的標(biāo)準(zhǔn)均采用MIT所開(kāi)發(fā)的TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)第6版的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。具體的分析及分類(lèi)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 ACE基因3'-UTR候選miRNA的種系恒定性

根據(jù)表1的結(jié)果，miR-27a和miR-27b兩個(gè)miRNA自身具有廣泛的種系恒定性(從靈長(zhǎng)類(lèi)到魚(yú)類(lèi)都存在)，且在ACE基因的結(jié)合位點(diǎn)上也具有種系恒定性(由進(jìn)化樹(shù)推導(dǎo))，因此被作為候選miRNA，進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

2.2 miR-27a/miR-27b的增強(qiáng)和抑制對(duì)ACE蛋白表達(dá)水平的影響 圖1可見(jiàn)，與預(yù)計(jì)完全一致，使用相應(yīng)的前體對(duì)miR-27a和miR-27b進(jìn)行功能增強(qiáng)顯著地減低了ACE的蛋白水平，而使用相應(yīng)的抑制劑對(duì)miR-27a和miR-27b進(jìn)行抑制則顯著地增加了ACE的蛋白水平。以miR-27a和miR-27b前體處理心肌細(xì)胞48 h后分別使ACE蛋白水平降低了30.32%(P=0.027)和36.35%(P=0.008);同時(shí)，以miR-27a和miR-27b抑制劑處理心肌細(xì)胞48 h分別導(dǎo)致ACE蛋白水平提高了42.06%(P=0.026)和65.39%(P=0.001)。在調(diào)節(jié)ACE蛋白水平方面，miRNA-27a和miR-27b二者之間無(wú)顯著性差異，無(wú)論是在其功能增強(qiáng)(P=0.834)還是在其功能抑制(P=0.280)的狀態(tài)下。

圖1 在miR-27a和miR-27b功能增強(qiáng)和功能抑制的情況下，ACE蛋白表達(dá)水平的變化

3 討論

冠心病與眾多的基因具有相關(guān)性〔9〕，而其中相當(dāng)一部分基因又有很多的miRNA參與調(diào)節(jié)〔10〕，因此這一領(lǐng)域的研究產(chǎn)生了較多的盲目性，需要一種研究手段對(duì)眾多的因素進(jìn)行進(jìn)一步的甄別和比較，以便使后續(xù)研究更具有針對(duì)性。本文采用了一個(gè)比較新穎的策略，就是一個(gè)基因的種系穩(wěn)定性，也就是所謂的保守性越好，則該基因具備的功能性可能就越基礎(chǔ)、越重要，這一策略借鑒了基因進(jìn)化的某些研究成果〔11〕。

本文選取了冠心病中一個(gè)極為重要的候選基因—ACE基因，對(duì)可能參與其調(diào)節(jié)的miRNA進(jìn)行了預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)的依據(jù)是miRNA“種子區(qū)”(seed region)學(xué)說(shuō)，這一學(xué)說(shuō)多次被國(guó)際一流研究雜志報(bào)道，也獲得學(xué)術(shù)界較為廣泛的認(rèn)同。由于miRNA和被調(diào)節(jié)基因之間沒(méi)有特定的、嚴(yán)格的對(duì)應(yīng)關(guān)系，具有“一對(duì)多、多對(duì)一”的特點(diǎn)，直接的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證難度和成本巨大，因此對(duì)調(diào)節(jié)特定基因的miRNA進(jìn)行預(yù)測(cè)尤為必要。本研究的預(yù)測(cè)依據(jù)一種組合策略〔12〕，這一策略有兩個(gè)候選條件：(1)從miRNA 5'端第一或第二堿基算起的7個(gè)連續(xù)堿基的“核”序列或“種子”序列與被調(diào)節(jié)基因3'端非轉(zhuǎn)錄區(qū)(UTR)部分序列構(gòu)成完全Watson-Crick匹配(即符合堿基配對(duì)原則的匹配);(2)上述“核”序列和3'-UTR對(duì)應(yīng)序列之間可以具有不匹配的堿基，只要兩者結(jié)合的自由能不增加并且不含G∶U配對(duì)。一個(gè)miRNA只要與某一基因具備上述情形之一，則可以認(rèn)為該miRNA具有調(diào)節(jié)該基因的可能。預(yù)測(cè)的結(jié)果顯示，200多個(gè)miRNA可能對(duì)ACE基因具有調(diào)節(jié)作用，根據(jù)miRNA自身的種系穩(wěn)定性以及在人類(lèi)ACE基因3'非轉(zhuǎn)錄區(qū)(UTR)所預(yù)測(cè)的結(jié)合位點(diǎn)的種系穩(wěn)定性，最后確認(rèn)miR-27a和miR-27b是最有可能對(duì)ACE基因產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用的候選miRNA。利用大鼠心肌細(xì)胞，在對(duì)miR-27a和miR-27b進(jìn)行增強(qiáng)和抑制的同時(shí)，本文觀察了ACE基因編碼的蛋白表達(dá)水平的變化。與理論預(yù)計(jì)一致，在miR-27a和miR-27b被增強(qiáng)時(shí)，ACE的表達(dá)水平明顯降低;而在miR-27a和miR-27b被抑制時(shí)，ACE的表達(dá)水平則明顯升高。

目前，有許多ACE抑制劑用于高血壓的治療，研究顯示ACE抑制劑在冠心病治療中的前景也是令人矚目的〔13〕。從機(jī)制而言，miR-27a和miR-27b可以通過(guò)抑制ACE基因表達(dá)從而作為內(nèi)源性的ACE抑制劑，其作用可以模擬ACE抑制劑的藥理作用。更重要的是，miRNA是機(jī)體自身的生理產(chǎn)物，沒(méi)有副作用，所以這一研究值得深入。

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