袁丹華 屈海琪 蔣 偉 楊國棟 安 芳 王書華 (河北北方學(xué)院藥學(xué)系，河北 張家口 075000)

金蓮花是毛茛科植物金蓮花的干燥花及花蕾，有清熱解毒，消腫明目的功效，臨床上主要用于上呼吸道感染、扁桃體炎、急性腸炎、泌尿系統(tǒng)感染等?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)金蓮花主要有效成分為黃酮類化合物〔1〕，前期研究表明，金蓮花黃酮中含量較高的是葒草苷和牡荊苷〔2〕，金蓮花總黃酮及其單體葒草苷和牡荊苷具有體外抗氧化、抑菌、抗腫瘤等作用〔3～6〕，藥代動力學(xué)研究表明葒草苷與牡荊苷在不同種屬動物組織的分布均沒有差異，腎臟中濃度最高，其次是肝，腦中含量最少〔7，8〕。有關(guān)金蓮花黃酮葒草苷和牡荊苷的體內(nèi)抗氧化作用尚未見報道，通過比較葒草苷和牡荊苷的體內(nèi)抗氧化作用，以期篩選出抗衰老作用最佳藥物的構(gòu)效關(guān)系，為抗衰老藥物的研究提供新的動力。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑 野生金蓮花采自河北省張家口沽源，經(jīng)我院藥物研究所鑒定為短瓣金蓮花 ;葒草苷和牡荊苷(自制，經(jīng)1H－NMR和HPLC鑒定純度98.9%);D-半乳糖(D-gal)，分析純，上海試一化學(xué)試劑有限公司;牛血清蛋白，分析純，鄭州益康有限公司;硫酸奎寧，分析純，上海齊奧化工有限公司;5，5-雙硫代對硝基苯甲酸，分析純，上海試一化學(xué)試劑有限公司;還原性谷胱甘肽，純度≥99%，國藥集團化學(xué)試劑有限公司;磷酸鈉，分析純，天津化工有限公司;鉬酸銨，分析純，天津化工有限公司鄰苯三酚，分析純，上海邦辰試劑有限公司;生理鹽水，石家莊第四制藥廠;超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶GSH-Px、丙二醛(MDA)測定試劑盒，均購買自南京建成生物工程研究所。

1.2 動物 健康的昆明種小鼠120只(雌雄各半)，河北北方學(xué)院動物中心提供(許可證號：SCXK京2004-0001)，分籠飼養(yǎng)，室溫18～25℃。

1.3 儀器 U-3900紫外可見分光光度計(日本);ME235S十萬分之一電子天平(日本);DK-8型電熱恒溫水槽(上海精密實驗設(shè)備有限公司);低溫高速離心機(賽多利斯公司);HQ-60型旋渦混合器(北方同正生物技術(shù)發(fā)展公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 造模方法 采用D-gal致亞急性衰老法，正常組注射等體積生理鹽水，造模時間為8 w，每天稱重1次，依據(jù)末次稱重的克數(shù)調(diào)整給藥劑量。

1.4.2 模型驗證 造模第6周和第8周分別選取正常組和造模組小鼠(備用)8只，摘眼球采血，分離血清，測定總抗氧化能力(T-AOC)、SOD含量，以驗證小鼠衰老情況。第8周末，造模組小鼠指標(biāo)與正常組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義，顯示模型復(fù)制成功。

1.4.3 藥物配制 葒草苷和牡荊苷溶液的配制：N，N-二甲基甲酰胺∶吐溫-80∶生理鹽水 =1∶1∶20。

1.4.4 給藥與分組 造模成功后，實驗分為模型組、正常組、維生素E對照組、葒草苷和牡荊苷高、中、低各三個劑量組，各治療組從第9周開始每日上午分別口服灌胃給藥，模型組和正常組給等體積的生理鹽水，每日一次。確定葒草苷和牡荊苷高、中、低劑量分別為 40、20、10 mg/kg，維生素 E 對照組每日20 mg/kg。每日稱重一次，依據(jù)小鼠每次的體重調(diào)整給藥劑量，給藥時間8 w。

1.5 觀察指標(biāo)與方法

1.5.1 小鼠一般狀態(tài)的觀察 觀察各組小鼠一般狀態(tài)，如攝食、飲水情況、體重、活動度、毛色、光澤度變化等方面，并相互進行比較。

1.5.2 小鼠組織中 SOD、CAT、GSH-Px、MDA的測定 給藥8 w后小鼠斷頭處死，冰浴條件下迅速取出腎、肝、腦組織，精確稱量，用生理鹽水制成10%的組織勻漿液，離心得上清液。取1.0 ml的上清液，加入1.0 ml乙醇-氯仿混合液，震蕩2 min，4 000 r/min離心5 min以除去蛋白質(zhì)，取上清液按試劑盒說明操作，測定SOD、CAT、GSH-Px的活性及MDA。

2 結(jié)果

2.1 金蓮花中葒草苷和牡荊苷對D-gal致衰老小鼠一般形態(tài)的影響 正常組小鼠飲食正常，活潑好動、毛發(fā)光亮、濃密，皮膚彈性良好。模型組小鼠在造模后，逐漸表現(xiàn)出少動，行動遲緩，喜蜷縮，毛色發(fā)黃，尤其是腹部毛發(fā)逐漸變得無光澤、稀疏并漸有脫毛現(xiàn)象，皮膚松弛，彈性下降。而各治療組在服用相應(yīng)的藥物后，總體狀態(tài)好于模型組。

2.2 葒草苷和牡荊苷對D-gal致衰老小鼠腎肝腦組織中SOD、CAT、GSH-Px、MDA的影響結(jié)果 見表1、表2。與正常組相比，模型組小鼠腎、肝、腦組織中SOD、CAT、GSH-Px含量明顯降低，MDA明顯升高，具有顯著性差異(P＜0.01)。與模型組相比，葒草苷和牡荊苷各治療組均具有提高小鼠組織 SOD、CAT、GSH-Px的作用和降低MDA的作用，具有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.01)。與維生素E對照組相比，葒草苷和牡荊苷中、低劑量組提高小鼠肝、腦、腎組織SOD、CAT、GSH-Px的作用和降低MDA的作用較弱，具有顯著性差異(P＜0.05)，高劑量組與維生素E組相比無顯著性差異。葒草苷中、低劑量組提高小鼠腎、肝、腦組織中SOD、CAT、GSH-Px的作用和降低MDA的作用高于牡荊苷中、低劑量組，具有顯著性差異(P＜0.05)，葒草苷與牡荊苷的高劑量組無顯著性差異。

表1 各組肝、腎、腦組織SOD、CAT水平( s，n=10)

表1 各組肝、腎、腦組織SOD、CAT水平( s，n=10)

與模型組比較：1)P＜0.01，與維生素E組比較：2)P＜0.05;與葒草甘中劑量組比較：3)P＜0.05;與葒草甘低劑量組比較：4)P＜0.05，下表同

組別 SOD(U/ml)腎肝腦CAT(U/ml)腎肝腦.915 6.625±0.826 6.025±0.908模型組 45.21±7.05 34.40±7.59 41.02±6.07 4.521±0.705 2.940±0.759 2.802±0.607維生素E組 80.36±6.681) 68.36±8.241) 88.36±6.971) 7.236±0.6681) 6.136±8.241) 5.736±0.6971)葒草甘高劑量組 89.76±6.021)2) 71.24±7.821) 67.36±7.121) 7.476±0.6021)2) 6.204±0.7821) 5.836±0.7121)葒草甘中劑量組 80.36±7.591) 60.23±7.061)2) 54.36±7.041)2) 6.236±0.7591) 5.230±0.7061)2) 4.936±0.7041)2)葒草甘低劑量組 68.32±6.341)2) 50.14±8.071)2) 43.36±6.891)2) 5.132±0.6341)2) 3.714±0.8071)2) 4.160±0.6891)2)牡荊苷高劑量組 72.24±6.861)2) 64.01±7.721)2) 58.36±8.011)2) 7.024±0.6861)2) 5.9181±0.6721)2) 5.536±0.8011)2)牡荊苷中劑量組 66.36±7.061)2)3) 56.68±7.911)2)3) 48.36±5.981)2)3) 5.236±0.7061)2)3) 4.068±0.7911)2)3) 4.436±0.5981)2)3)牡荊苷低劑量組 60.36±6.591)2)4) 42.68±8.121)2)4) 43.36±6.131)2) 3.836±0.6591)2)4) 3.268±0.8121)2)4) 3.636±0.6131)2)正常組 104.08±9.15 92.17±8.26 110.24±9.08 8.208±0

表2 各組肝、腎、腦組織GSH-Px、MOA水平( s，n=10)

表2 各組肝、腎、腦組織GSH-Px、MOA水平( s，n=10)

組別 GSH-Px(U/ml)腎肝腦MDA(U/ml)腎肝腦4 14.52±3.26 8.48±2.37模型組 18.39±1.65 17.98±1.15 8.37±1.43 29.68±2.36 24.25±2.54 15.97±3.36維生素E組 32.10±2.041) 30.51±1.671) 14.25±2.071) 18.53±3.271) 17.52±3.141) 10.26±2.011)葒草甘高劑量組 33.42±1.961) 29.88±1.161) 13.34±1.691) 19.10±3.091) 16.35±2.581) 11.22±3.761)葒草甘中劑量組 30.24±1.041) 26.32±1.181)2) 12.40±1.371)2) 21.56±2.541) 18.71±2.021) 12.25±2.631)葒草甘低劑量組 26.21±1.941)2) 22.93±1.201)2) 10.56±2.141)2) 24.65±3.651)2) 20.32±4.011)2) 13.69±3.591)2)牡荊苷高劑量組 32.46±1.021) 27.57±0.941) 13.02±2.031) 20.46±2.581) 17.34±3.611) 11.97±3.241)牡荊苷中劑量組 25.26±1.651)2)3) 23.16±1.061)2)3) 11.93±1.971)2) 22.87±3.521)2) 19.24±2.971) 13.01±3.061)牡荊苷低劑量組 20.64±1.291)2)4) 19.94±1.681)2)4) 10.96±1.211)2) 25.36±2.831)2) 21.04±2.431)2) 13.89±2.521)2)正常組 34.56±1.12 32.46±1.10 16.58±2.05 15.17±3.6

3 討論

D-gal亞急性衰老模型是研究抗衰老藥物的經(jīng)典模型。D-gal在醛糖還原酶的作用下生成半乳糖醇，而后者不能被細胞進一步代謝，進而造成細胞代謝紊亂，破壞并消耗機體抗氧化物質(zhì)，并不斷產(chǎn)生自由基，導(dǎo)致組織細胞受損，使細胞腫脹、功能障礙，從而造成實驗性亞急性衰老模型。

在正常代謝情況下，機體產(chǎn)生和清除自由基處于一種動態(tài)平衡中。內(nèi)源性的清除自由基的酶系有SOD、CAT、GSH-Px等，外源性的清除劑有維生素E、維生素C以及從植物提取出的黃酮類等化合物。T-AOC主要維持內(nèi)環(huán)境活性氧自由基的動態(tài)平衡，清除濃度過高的活性氧自由基，使機體處于相對穩(wěn)定的狀態(tài)，它可代表抗氧化酶促系統(tǒng)和非酶促系統(tǒng)的變化。SOD可以催化超氧陰離子自由基的歧化反應(yīng)，產(chǎn)生破壞能力相對較低的H2O2，而CAT和 GSH-Px能將H2O2分解成H2O和O2，減輕或阻斷脂質(zhì)過氧化作用的一級引發(fā)作用，保護機體免受過氧化氫的侵害，延緩細胞的衰老，從而預(yù)防自由基導(dǎo)致的疾病的發(fā)生〔9，10〕。根據(jù)自由基學(xué)說，適當(dāng)補充外源性自由基清除劑，增強肌體自由基防御系統(tǒng)能力，即可達到抗衰老的目的。MDA是氧自由基引起細胞脂質(zhì)過氧化損傷的終產(chǎn)物，是極其活潑的交聯(lián)劑，能與蛋白質(zhì)、核酸等交聯(lián)，從而使其變性甚至失活，MDA可反映機體內(nèi)過氧化程度，間接反映出細胞的受損程度〔11〕。

本實驗結(jié)果表明葒草苷和牡荊苷在提高機體內(nèi)SOD、CAT、GSH-Px的活性方面發(fā)揮較好的作用，且葒草苷和牡荊苷均能降低組織內(nèi)的MDA的含量，提示葒草苷和牡荊苷可能通過直接清除體內(nèi)氧自由基，激活抗氧化酶系的防御系統(tǒng)等作用，提高機體的抗氧化能力，減少自由基對機體的損傷，從而起到延緩衰老的作用。其中葒草苷中、低劑量組提高機體抗氧化酶和降低組織MDA的作用分別比牡荊苷中、低劑量組的作用強，這與文獻所說B環(huán)上連有一個酚羥基的黃酮抗氧化性比B環(huán)上具有鄰二酚羥基的黃酮抗氧化活性要弱些相一致〔12〕。高劑量組與維生素E作用相當(dāng)。

從中醫(yī)理論角度上說，腎藏象在中醫(yī)臟腑中占有重要的地位，所謂腎氣絕，則不盡其天命而死也;天壽過度，氣脈常通，而腎氣有余也〔13〕。腎在抗衰老作用中起著巨大的作用，金蓮花黃酮類單體藥代動力學(xué)理論證明金蓮花黃酮單體葒草苷和牡荊苷，在腎中濃度最高，可見金蓮花黃酮類單體具有很大的研究價值，也為進一步研究的抗氧化作用打下了堅實的基礎(chǔ)。本文通過對葒草苷和牡荊苷的藥理學(xué)研究，從中醫(yī)的角度證明其具有提高機體的抗氧化抗衰老的能力。

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