邵麗媛 李 淼 盧雪紅 吳 曼 羅 萍 (前郭縣縣醫(yī)院血液透析室，吉林 松原 306)

隨著對糖尿病腎病(DN)的研究不斷深入，發(fā)現糖尿病(DM)患者合并的腎臟損害不一定都是DN。DM腎臟疾病(DKD)不僅包括傳統意義上的DN，還包括DM合并的非DM性腎臟疾病(NDRD)〔1〕。本研究在構建DN大鼠模型、膜性腎病(MN)模型的基礎上，創(chuàng)新性地構建DN伴MN大鼠模型，為進一步研究DM合并NDRD的機制奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 正常健康雄性Wistar大鼠，180～200 g，吉林大學基礎醫(yī)學院動物實驗中心提供。隨機將大鼠分為正常組(NC，n=10)，DN 組(n=10)，MN 組(n=15)，DN+MN組(DN+MN，n=20)。

1.2 主要試劑及儀器 小牛血清白蛋白(BSA，購自上海緣聚生物科技有限公司)，碳化二亞胺(EDC，國藥集團)，鏈脲佐菌素(STZ，購自Sigma公司)，BM-V型自動組織包埋機(湖北省醫(yī)用電子儀器廠)，半自動石蠟切片機(英國Thermo Shandon公司)，BX40型Olympus顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3 方法

1.3.1 建立大鼠MN模型 將無水乙二胺(EDA)67 ml溶于500 ml蒸餾水中，再加入6 mol/L鹽酸350 ml，溫度控制在25℃，將pH調整至4.75，加BSA 5 g溶于25 ml蒸餾水中，接著加EDC 1.8 g，繼續(xù)維持原溫度與pH值，均勻攪拌2 h。上述物質在4℃蒸餾水中透析48 h，最后冷凍干燥為結晶粉末，用聚丙烯酰胺等測定等電點(PI＞8.5即可)。C-BSA放冰箱備用。將C-BSA 5 mg溶于生理鹽水中(配制濃度為10 mg/ml)，與等體積不完全弗氏佐劑乳化，大鼠皮下多點注射作預免疫。預免疫1 w后，開始正式免疫。每只大鼠每次給予C-BSA 16 mg/kg〔2〕尾靜脈注射，3次/d，連續(xù)注射4 w。用尿蛋白測定試紙條檢測尿蛋白?，則MN模型成功。

1.3.2 大鼠DM模型及DN模型的建立 隨機選取大鼠，禁食16 h，腹腔注射新鮮配制的 STZ〔3〕(55 mg/kg，溶于 0.9% 的生理鹽水中)一次，連續(xù)3 d檢測血糖、尿糖，尿糖定性?以上、血糖＞13.8 mmol/L，并持續(xù)上述標準不變者，確定DM造模型成功。NC組注射等量的0.9%生理鹽水。觀察大鼠一般狀態(tài)、飲食、飲水量、尿量及活動情況。DM模型成功后，繼續(xù)檢測大鼠血糖＞16.7 mmol/L、尿蛋白測定試紙條檢測尿蛋白為(+～?)、尿微量白蛋白＞15 μg/ml，則 DN造模成功。

1.3.3 DN合并MN大鼠模型的制作 隨機抽取成功造模的DN模型大鼠(n=20)，按1.2.1DN模型構建方法處理。共4 w。8 w后處死大鼠，處死前心臟采血、留取腎臟組織。

1.3.4 標本采集與檢測 各組大鼠每周于處死前24 h置于代謝籠中收集24 h尿液，考馬斯亮藍法檢測24 h尿蛋白定量。左側腎臟稱重，留取腎皮質于－80℃保存用于檢測蛋白及RNA;右腎皮質，部分留取新鮮標本，取出后迅速制成冰凍切片，于4℃保存。用于免疫熒光檢測部分置于10%甲醛內固定制作光鏡標本，過碘酸雪夫(PAS)、高碘酸-六胺銀(PASM)及膠原纖維(MASSON)常規(guī)染色。熒光顯微鏡及光鏡下觀察腎臟病理變化。

1.4 統計學方法 應用SPSS11.5統計軟件進行分析，數據以s表示，組間資料比較采用方差分析。

2 結果

2.1 一般狀態(tài) NC組大鼠普通飲食、飲水如常，大小便正常，活潑健壯，體毛有光澤。DN組24 h攝食量、飲水量大約為NC組的兩倍，尿量明顯增多，大便稀溏，體重明顯減輕。MN組有不同程度的攝食減少、精神不振、尿量減少、身體消瘦、蜷縮、體毛失去光澤、大便稀爛等現象，部分出現少量腹水。DN+MN組大鼠出現精神不振，多飲、多食、多尿及體重減輕，一部分出現腹水及肉眼血尿，其中1只死亡。

2.2 各組24 h尿蛋白的變化 見表1。

表1 各組大鼠24 h尿蛋白定量的變化( s ，g)

表1 各組大鼠24 h尿蛋白定量的變化( s ，g)

與NC組比較：1)P＜0.05

組別 n.16 DN 10 5.09±0.241) 16.7±0.431) 17.0±1.081) 16.3±6.251)MN 15 23.58±3.491)128.21±32.381)142.42±49.071)148.42±49.451)DN+MN19 27.18±3.871) 146.21±40.331) 150.45±45.671) 155.67±56.671)2 w 4 w 6 w 8 w NC 10 10.45±2.48 9.24±1.82 10.35±1.57 9.97±3

2.3 腎臟病理學改變 NC組大鼠腎臟病理正常;DN組大鼠腎臟表現為腎小球體積增大，腎小球系膜區(qū)彌漫性增寬，細胞外基質彌漫增多，可見毛細血管基底膜增厚及毛細血管腔閉塞;MN組腎小球毛細血管壁增厚、僵硬，偶見釘突形成，上皮下嗜復紅物存在，小管內可見蛋白管型;DN+MN組大鼠腎小球體積增大，系膜細胞增生，系膜基質增多，彌漫性基底膜增厚，腎小管上皮細胞彌漫性顆粒樣變性，局灶性空泡樣變性，小管腔內可見蛋白管型。見圖1。

圖1 各組大鼠腎臟病理PAM染色(×400)

3 討論

DN是引起終末期腎衰的重要原因，蛋白尿作為DN的臨床表現，是DM進展到DN的一個重要標志，其排出量的多少預示著病情的嚴重程度。很多學者發(fā)現DM合并大量蛋白尿的患者經腎活檢證實并非由DN所致，而是因為合并了原發(fā)性腎小球疾病，尤以合并MN居多〔4～6〕。對既存的DN以外的腎臟疾病進行積極而有效的治療，可避免因為合并NDRD而導致腎功能迅速惡化。

在DN合并MN大鼠模型制作中，如何安排DN模型和MN模型建立的先后順序是關鍵之處。STZ誘導的DM動物模型具有病情相對穩(wěn)定、存活時間長等特點，繼發(fā)的腎臟病變呈漸進性，常用于DN模型的進一步誘發(fā)和研究。由于DN大鼠比正常大鼠對C-BSA敏感，故而在DN大鼠模型基礎上建立MN模型更加有效，時間更短。DN組大鼠外周血管細，免疫力降低，改用腹腔注射替代尾靜脈注射C-BSA制備DN合并MN大鼠模型，其原理與C-BSA誘導MN大鼠模型的原理相似。

如何驗證DN模型、MN模型、DN合并MN模型成功?DN模型的驗證方法標準不一，本文采用楊亦彬等〔3〕的診斷標準只有持續(xù)的體內高血糖環(huán)境才能加速DN的形成，因此需每周監(jiān)測大鼠血糖，均穩(wěn)定高于16.7 mmol/L。DN組基本可模擬出人類2型DN的典型病理變化。DM大鼠血管改變在3個月時就已出現，但本模型中腎小管萎縮和間質纖維化病變不明顯，這可能與時間有關。MN的成模標準：造模后大鼠出現消瘦，納差，精神不振，活動減少，毛色枯槁，脫落，抓持反抗能力減弱，部分大鼠出現腹水，陰囊水腫;腎臟組織學檢查顯示，造模4 w后大鼠的腎小球基底膜呈不規(guī)則增厚，基質增多，上皮下嗜復紅物存在，腎小管內可見蛋白管型。DN合并MN成模標準：病理表現為腎小球體積增大，腎組織出現系膜細胞增生、基質增多，彌漫性基底膜增厚，腎小球上皮細胞下嗜復紅物存在，腎小管上皮細胞彌漫性顆粒樣變性，小管內可見蛋白管型。通過腎臟病理可以判斷動物模型制作是否成功。實驗中需要注意的問題有：動物造模時間長，大約3個月，而DM大鼠抵抗力低下，為保證大鼠造模成功，要特別注意飼養(yǎng)環(huán)境，有清潔充足的水源、食物;DM大鼠尿量多，墊料潮濕，要勤換敷料;預防感染，腹腔注射、皮下注射及采血等侵入性操作前后，注意消毒;血糖＞35 mmol/L時，補充中效胰島素;禁食后的大鼠，注射時候已經處于低血糖狀態(tài)，造模4 h后根據血糖情況，腹腔注射20%葡萄糖以避免因注射時血糖過低導致大鼠死亡。在測24 h尿蛋白定量時，考慮到糖尿病大鼠24 h禁食容易出現低血糖死亡，采用留15 h尿量、換算其24 h尿蛋白總量的方法。

總之，本實驗制備了DN、MN動物模型，并成功誘導出DN合并MN的動物模型，為進一步的機制研究奠定了基礎。

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2 梁 靜，孫興旺，曹 靈，等.不同劑量陽離子化牛血清白蛋白對膜性腎病大鼠造模的影響〔J〕.中國組織工程研究與臨床康復，2008;12(37)：7322-5.

3 楊亦彬，張 翥，蘇克亮，等.鏈脲佐菌素誘導大鼠糖尿病腎病模型的方法學探討〔J〕. 華西醫(yī)學，2005;20(2)：299-300.

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5 Pham TT，Sim JJ，Kujubu DA，et al.Prevalence of nondiabetic renal disease in diabetic patients〔J〕.Am J Nephrol，2007;27(3)：322-8.

6 李 璇，孫雪瑩，王 瓊，等.鏈佐星-弗氏完全佐劑作用大鼠糖尿病腎病模型〔J〕.南京中醫(yī)藥大學學報，2008;24(4)：257-60.