張 虹 季有波 (長(zhǎng)春醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，吉林 長(zhǎng)春 3003)

中醫(yī)認(rèn)為乳腺癌或癌前病變屬于“乳巖”、“乳癖”范疇，乃由情志不暢、肝郁氣滯、血瘀、脾氣消沮等所致。而逍遙散行氣疏肝，調(diào)暢神志，具有抗焦慮、抗抑郁作用，從而影響癌癥的發(fā)生發(fā)展〔1〕。本課題組在前期研究中證實(shí)了逍遙散提取液對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7有顯著的生長(zhǎng)抑制作用〔2〕。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討逍遙散提取液對(duì)細(xì)胞周期的影響，為古方新用及乳腺癌的防治進(jìn)一步提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與試劑

1.1 試劑 DMEM 培養(yǎng)基(Invitrogen)、RNase、PI購(gòu)自 Sigma公司;胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料研究所。

1.2 藥物 逍遙散的藥物組成及用量為：柴胡、當(dāng)歸、白術(shù)、茯苓、芍藥各30 g，炙甘草15 g，煨姜、薄荷各1 g，購(gòu)自市售藥店，并經(jīng)過嚴(yán)格鑒定。按上述組方和單品藥當(dāng)歸取生藥，加蒸餾水回流提取3次，每次分別為60、30、30 min，濃縮藥液，再加入DMEM培養(yǎng)液稀釋，配成濃度為1 g/ml藥液，過濾除菌，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌細(xì)胞系(MCF-7)購(gòu)自吉林省腫瘤研究所，置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2空氣及飽和濕度條件下培養(yǎng)。以每5×104細(xì)胞/瓶接種，24 h換液1次并加入相應(yīng)濃度的逍遙散提取液。

1.4 FCM檢測(cè)細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞周期 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)分5組：對(duì)照組、逍遙散提取液低劑量組(2 mg/ml)、中劑量組(5 mg/ml)、高劑量組(10 mg/ml)、當(dāng)歸組(5 mg/ml)。按照常規(guī)方法用PI染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期〔3〕。經(jīng)低、中、高劑量的逍遙散提取液和當(dāng)歸分別作用48 h，收集MCF-7細(xì)胞，用PBS沖洗兩次，70% 冷乙醇固定過夜。PBS沖洗2次，加RNase，37℃水浴30 min降解RNA;再用PBS洗2次后，加PI染液，4℃避光反應(yīng)30 min，經(jīng)PBS洗滌后上機(jī)檢測(cè)。用FACScan流式細(xì)胞儀Cellfit軟件收取細(xì)胞測(cè)定DNA含量的變化，每個(gè)樣品收集細(xì)胞數(shù)為1×104個(gè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均采用SAS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行檢測(cè)，數(shù)據(jù)用s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，不同劑量的逍遙散提取液和當(dāng)歸提取液對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7作用48 h后，各周期細(xì)胞比例見表1。

表1 逍遙散提取液對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7細(xì)胞周期的影響( s ，%)

表1 逍遙散提取液對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7細(xì)胞周期的影響( s ，%)

與對(duì)照組比較：1)P ＜0.05，2)P ＜0.01

組別 G0/G1 S G2/M逍遙散低劑量組 63.813±0.783 35.828±0.9551) 0.480±0.1231)中劑量組 55.615±1.4532) 28.258±3.7201) 0.207±0.1001)高劑量組 54.463±2.6962) 25.430±4.2461) 0.190±0.1471)對(duì)照組 64.763±2.202 36.238±1.110 0.597±0.076當(dāng)歸組68.250±3.990 31.500±4.210 0.250±0.250

3 討論

細(xì)胞周期是指細(xì)胞從第一次分裂結(jié)束產(chǎn)生新細(xì)胞到第二次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過程，分為間期與分裂期(M期)兩個(gè)階段。分裂間期是物質(zhì)準(zhǔn)備和積累階段，分裂期則是細(xì)胞增殖的實(shí)施過程。間期又分為休眠期(G0期)、DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)與DNA合成后期(G2期)，在此期間主要完成染色質(zhì)中的DNA復(fù)制和相關(guān)蛋白質(zhì)的合成。M期為細(xì)胞分裂期，在此期間進(jìn)行細(xì)胞物質(zhì)的平均分配，一個(gè)細(xì)胞經(jīng)過分裂形成兩個(gè)新的細(xì)胞。

在細(xì)胞周期中，S期是細(xì)胞增殖的關(guān)鍵，其最主要的特征是DNA的合成，DNA分子的復(fù)制就是在這個(gè)時(shí)期進(jìn)行的。通常只要DNA的合成一開始，細(xì)胞增殖活動(dòng)就會(huì)進(jìn)行下去，直到分裂成兩個(gè)子細(xì)胞。因此通過某種因素進(jìn)行干擾、破壞或抑制DNA合成，就可以抑制癌細(xì)胞增殖，從而達(dá)到治療癌癥的目的。例如，放射線能破壞癌細(xì)胞DNA的結(jié)構(gòu)與合成，治療某些腫瘤〔4〕;藥物秋水仙堿等則可阻止紡錘體的形成，從而抑制癌細(xì)胞的分裂〔5〕。

因?yàn)閱挝懂?dāng)歸可能有促進(jìn)婦女乳腺癌細(xì)胞增生的作用〔6〕，因此本實(shí)驗(yàn)采用當(dāng)歸提取液組作對(duì)照。本實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果表明，逍遙散提取液3個(gè)不同濃度組對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7作用48 h后，S期細(xì)胞比例降低，且隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞比例降低更明顯。提示逍遙散提取液可通過阻斷乳腺癌細(xì)胞MCF-7 DNA合成的方式，抑制乳腺癌細(xì)胞體外增殖;而單味當(dāng)歸亦無(wú)促進(jìn)DNA合成作用。

1 吳在德.外科學(xué)〔M〕.第5版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2001：1.

2 王 迪，張 虹，付士波，等.逍遙散對(duì)乳腺癌細(xì)胞抑制作用實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.中醫(yī)藥學(xué)刊，2006;(4)：643-4.

3 蘇 旭，張迎春.胸腺細(xì)胞體外培養(yǎng)對(duì)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期進(jìn)程的影響〔J〕. 白求恩醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1995;15(21)：447.

4 鞠桂芝，付士波，劉建香，等.X射線照射對(duì)EL-4淋巴瘤細(xì)胞周期進(jìn)程及細(xì)胞倍增時(shí)間的影響〔J〕.輻射研究與輻射工藝學(xué)報(bào)，1998;18(16)：157-60.

5 高沛永，王 瓊.秋水仙堿引起CHL細(xì)胞有絲分裂紡錘體損傷的觀察〔J〕.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，1993;13(4)：259-61.

6 戴 軍.人參當(dāng)歸可能誘發(fā)乳腺癌 專業(yè)人士建議婦女慎用〔J〕.保健時(shí)報(bào)，2004;20(4)：1.