吐?tīng)柡椤た司S爾 袁曉華 穆斯塔帕 喬艷輝 左宏莉 (烏魯木齊市血液中心，新疆 烏魯木齊 830000)

EB病毒轉(zhuǎn)化外周血 B淋巴細(xì)胞，使其成為一種能連續(xù)分裂永久生存的類(lèi)淋巴母細(xì)胞，可作為生物標(biāo)本庫(kù)建立的首選方法，使具有特定生物學(xué)性狀的標(biāo)本得以長(zhǎng)期保存，以便進(jìn)行深入研究。近年來(lái)關(guān)于新疆和田老人長(zhǎng)壽分子機(jī)制的研究已經(jīng)取得一定進(jìn)展〔1，2〕，更加深入的研究需要對(duì)長(zhǎng)壽人群及對(duì)照組的遺傳物質(zhì)進(jìn)行深入的比對(duì)分析，來(lái)源穩(wěn)定和充足的研究樣本是必要條件，而長(zhǎng)壽老人的血液樣本屬于不可再生的珍貴資源，建立永生細(xì)胞株可以很好地解決。目前國(guó)內(nèi)能利用EB病毒轉(zhuǎn)化外周血B淋巴細(xì)胞成功建立永生細(xì)胞系的實(shí)驗(yàn)室并不多，文獻(xiàn)報(bào)道的各自轉(zhuǎn)化方法和轉(zhuǎn)化成功率不盡相同，對(duì)成功率的影響因素眾多?，F(xiàn)有的轉(zhuǎn)化方法主要有四種，均可成功建系，一般按建系效率從高到低依次為：環(huán)孢霉素A法、凍存白細(xì)胞法、凍存全血法和微量全血法〔3，4〕。在血量充足、實(shí)驗(yàn)室可就近盡快實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的情況下，可選擇環(huán)孢霉素A法。由于新疆地域遼闊，采樣點(diǎn)遙遠(yuǎn)分散，采用凍存全血法進(jìn)行永生細(xì)胞轉(zhuǎn)化具有操作簡(jiǎn)單、所需標(biāo)本量少及無(wú)需環(huán)孢霉素A的優(yōu)點(diǎn)，便于遠(yuǎn)距離分散采血、集中轉(zhuǎn)化。但該方法存在轉(zhuǎn)化效率低、轉(zhuǎn)化周期長(zhǎng)的缺點(diǎn)。有報(bào)道長(zhǎng)壽老人淋巴細(xì)胞的在采用環(huán)孢霉素A 法時(shí)，轉(zhuǎn)化效率相對(duì)青壯年要低〔5，6〕，僅為 66.67%(24/36)，而后者成功率可達(dá)95%以上，目前還沒(méi)有將凍存全血法用于長(zhǎng)壽老人淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的報(bào)道，為了提高凍存全血法的轉(zhuǎn)化效率，本研究從避免冷凍損傷、減少紅細(xì)胞干擾角度出發(fā)，對(duì)該方法進(jìn)行改進(jìn)。

1 材料與方法

1.1 試劑 RPMI1640(GIBCO)，F(xiàn)BS(Hyclone)，EB病毒株(B95-8，購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù))，淋巴細(xì)胞分離液 Ficol1(天津川貝)，DNA提取試劑盒(美國(guó)TE)，HLA分型檢測(cè)，SSO熒光微珠流式分型試劑(LABType SSO，One Lambda)。

1.2 儀器 超凈工作臺(tái)，CO2恒溫培養(yǎng)箱，－80℃超低溫冰箱，24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(CORNING)，25 cm2一次性培養(yǎng)瓶(CORNING)，凍存管(CORNING)，離心機(jī)，液氮罐，熒光微珠流式分析(Luminex)，HLATools結(jié)果判讀分析軟件(One Lambda)。

1.3 方法

1.3.1 采樣 長(zhǎng)壽老人年齡界定按5步法確認(rèn)，具體方法參照文獻(xiàn)〔2，3〕，采樣在知情同意的原則下進(jìn)行，并簽署知情同意書(shū)，對(duì)采樣對(duì)象采集5 ml肝素抗凝血用于轉(zhuǎn)化和2 ml EDTA抗凝血用于提取DNA，常溫下48 h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室。每份血樣的轉(zhuǎn)化采取環(huán)孢霉素A和凍存全血法雙線(xiàn)進(jìn)行，分別采取兩種方法凍存至液氮，1 w以上后再以?xún)龃嫒◤?fù)蘇轉(zhuǎn)化。

1.3.2 EB病毒上清的制備EB病毒株(狨猴B95-8)用含20%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基在37℃，5%CO2條件下饑餓培養(yǎng)1～2 w后收集細(xì)胞，離心，2 000 r/min×10 min。收集上清，0.22 μm濾膜過(guò)濾。

1.3.3 凍存全血法轉(zhuǎn)化永生細(xì)胞 采用兩種方法凍存全血：方法一，全血中直接添加10%DMSO，每管1 ml凍存;方法二，先配制含20%DMSO的小牛血清冷凍保護(hù)液，再添加至全血中，使DMSO的終濃度為5%，每管1 ml凍存。細(xì)胞凍存管均放置于程序降溫盒中－80℃冰箱過(guò)夜后轉(zhuǎn)至液氮凍存。細(xì)胞凍存1 w以上后分批在37℃水浴快速?gòu)?fù)蘇，加入8 ml RPMI1640培養(yǎng)基，3 000 r/min離心洗滌2 min，棄上清，細(xì)胞沉淀物加入新鮮EBV上清1.2 ml和含20%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基1 ml吹打均勻，加入25 ml培養(yǎng)瓶或24孔板中在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

1.3.4 細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇 轉(zhuǎn)化成功的細(xì)胞生長(zhǎng)至一定密度，以含10%DMSO的小牛血清凍存至液氮，在37℃水浴快速?gòu)?fù)蘇進(jìn)行繼代培養(yǎng)。

1.3.5 細(xì)胞的HLA基因分型 轉(zhuǎn)化前EDTA抗凝血的DNA提取方法為酚氯仿抽提法，培養(yǎng)后永生細(xì)胞株的DNA提取方法為T(mén)E試劑盒法。HLA的基因分型采用PCR-SSO熒光微珠流式雜交分型技術(shù)對(duì)HLA-A、B、DRB1位點(diǎn)進(jìn)行分型檢測(cè)。

2 結(jié)果

采用凍存全血法轉(zhuǎn)化新疆和田地區(qū)長(zhǎng)壽老人外周血淋巴細(xì)胞，共建立百歲長(zhǎng)壽老人永生細(xì)胞14株，其中男性8株，女性6株。方法一復(fù)蘇后顯微鏡下背景含大量紅細(xì)胞，觀察到淋巴細(xì)胞出現(xiàn)轉(zhuǎn)化跡象的時(shí)間為15～20 d(圖1)，僅建成一株長(zhǎng)壽老人永生細(xì)胞(1/14)。方法二復(fù)蘇后鏡下背景干凈，紅細(xì)胞殘留很少，淋巴細(xì)胞出現(xiàn)轉(zhuǎn)化跡象的時(shí)間為3～5 d(圖2)，轉(zhuǎn)化成功率為100%。轉(zhuǎn)化的B淋巴母細(xì)胞經(jīng)擴(kuò)增傳代培養(yǎng)至第2～3代后凍存至液氮，每株凍存2支。

建成的細(xì)胞株凍存后復(fù)蘇的成功率為100%，經(jīng)復(fù)蘇傳代擴(kuò)增培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，細(xì)胞培養(yǎng)至第10代左右時(shí)經(jīng)染色體G顯帶分析未見(jiàn)異常。對(duì)培養(yǎng)的永生細(xì)胞提取DNA，與轉(zhuǎn)化前提取的 DNA一同做 HLA基因分型，36號(hào)樣本為：A2A24B13B35DR7DR11，轉(zhuǎn)化前后結(jié)果一致，證明了轉(zhuǎn)化的永生細(xì)胞保留了原有個(gè)體的完整基因組信息。

圖1 方法一轉(zhuǎn)化3 d和10 d時(shí)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化跡象(×200)

圖2 方法二轉(zhuǎn)化3 d和10 d時(shí)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化跡象(×200)

3 討論

EB病毒通過(guò)結(jié)合人B淋巴細(xì)胞表面上的EB病毒受體而感染B淋巴細(xì)胞，導(dǎo)致B淋巴細(xì)胞的永生性生長(zhǎng)，該方法在國(guó)外的報(bào)道始見(jiàn)于1986年Neitzel等〔7〕，國(guó)內(nèi)最早報(bào)道在1995年〔8〕，2002年人類(lèi)基因組計(jì)劃后采用該方法大規(guī)模轉(zhuǎn)化少數(shù)民族永生細(xì)胞并建庫(kù)〔9，10〕，但由于影響轉(zhuǎn)化成功的實(shí)驗(yàn)條件很多，國(guó)內(nèi)各實(shí)驗(yàn)室之間報(bào)道的轉(zhuǎn)化方法和轉(zhuǎn)化效率存在差別〔3〕。

在現(xiàn)有報(bào)道的四種EB病毒轉(zhuǎn)化方法中，環(huán)孢霉素A法和凍存白細(xì)胞法轉(zhuǎn)化效率最高，出現(xiàn)轉(zhuǎn)化跡象最快只需3～5 d，一個(gè)月即可成功建系，但該方法需要先用淋巴細(xì)胞分離液依據(jù)細(xì)胞比重不同將淋巴細(xì)胞從全血中離心分離出來(lái)，再洗滌得到的細(xì)胞，該過(guò)程步驟多且較費(fèi)時(shí)，淋巴細(xì)胞得率影響轉(zhuǎn)化效率，且需要在轉(zhuǎn)化初期加入環(huán)孢霉素A以避免轉(zhuǎn)化后T淋巴細(xì)胞的免疫效應(yīng)。微量全血法和凍存全血法所需血量較少，且操作簡(jiǎn)單，不需環(huán)孢霉素A，尤其是凍存全血法可以實(shí)現(xiàn)分散采樣凍存后集中轉(zhuǎn)化，但這兩種方法存在轉(zhuǎn)化效率低、建系周期長(zhǎng)的問(wèn)題，出現(xiàn)轉(zhuǎn)化跡象的淋巴細(xì)胞通常要在兩周以上才能在密集的紅細(xì)胞背景下觀察到，建系要兩個(gè)月左右。本研究通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，認(rèn)為微量全血法和凍存全血法在轉(zhuǎn)化前期的大量紅細(xì)胞是影響轉(zhuǎn)化成功率和轉(zhuǎn)化周期的一個(gè)重要因素，隨著紅細(xì)胞的不斷凋亡、裂解，釋放出大量血紅蛋白和細(xì)胞因子，可能會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)化中的淋巴細(xì)胞活性產(chǎn)生不利影響〔11〕。

本研究對(duì)傳統(tǒng)凍存全血法與改進(jìn)的凍存全血法進(jìn)行比較，傳統(tǒng)凍存全血法中，細(xì)胞解凍后存在大量紅細(xì)胞殘留，在顯微鏡下無(wú)法觀察到淋巴細(xì)胞，而改進(jìn)后的凍存方法，紅細(xì)胞殘留很少，淋巴細(xì)胞活性較好，鏡下觀察轉(zhuǎn)化背景干凈清楚。兩種方法的差別主要在于DMSO濃度。紅細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與淋巴細(xì)胞存在很大區(qū)別，前者無(wú)細(xì)胞核以及獨(dú)特的膜結(jié)構(gòu)使其更加脆弱，對(duì)冷凍保護(hù)劑的分子大小和滲透性要求與淋巴細(xì)胞不同，其最佳冷凍保護(hù)劑是20%～40%的甘油，在添加及洗脫時(shí)還要根據(jù)滲透性逐步添加去除〔12〕。DMSO作為滲透性冷凍保護(hù)劑，分子量小于甘油，進(jìn)出細(xì)胞速度更快，對(duì)淋巴細(xì)胞起到很好的冷凍保護(hù)作用，在10%的濃度下，DMSO快速出入紅細(xì)胞膜，部分避免了凍存過(guò)程中的冰晶破壞作用，使復(fù)蘇后紅細(xì)胞雖然活性大大降低，但仍保持完整膜結(jié)構(gòu)，在隨后的培養(yǎng)過(guò)程中，紅細(xì)胞不斷裂解，產(chǎn)生碎片，釋放出游離血紅蛋白，影響了轉(zhuǎn)化中的淋巴細(xì)胞活性。在改進(jìn)的凍存方法中，DMSO濃度降低到了5%，同時(shí)添加小牛血清作為非滲透性的保護(hù)劑，二者同時(shí)存在對(duì)淋巴細(xì)胞起到了冷凍保護(hù)作用，此時(shí)5%的DMSO不足以保護(hù)紅細(xì)胞的膜完整性，在復(fù)蘇后的細(xì)胞洗滌過(guò)程可以將大量的紅細(xì)胞殘?jiān)コ苊饬似浜髮?duì)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的不利影響，實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)化周期縮短、成功率提高。

本研究首次將改進(jìn)的凍存全血法用于長(zhǎng)壽老人永生細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，成功率100%，且轉(zhuǎn)化周期與環(huán)孢霉素A相同，與傳統(tǒng)轉(zhuǎn)化全血法相比，大大提高了轉(zhuǎn)化效率，建立了長(zhǎng)壽老人永生細(xì)胞株，為進(jìn)一步的研究提供了充足的實(shí)驗(yàn)材料。

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