張向萍 張洪濤 修春明 遲 楠 崔廣強 王云波 湯國太

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬煙臺毓璜頂醫(yī)院藥劑科，山東 煙臺 264000)

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的腫瘤預(yù)后差，復(fù)發(fā)率高。環(huán)氧化酶-2(COX-2)在包括膠質(zhì)瘤在內(nèi)的多種人體腫瘤中均有較高水平的表達(dá)，而且與腫瘤的增殖、凋亡、血管生成、轉(zhuǎn)移及免疫缺陷等有密切的關(guān)系;前列環(huán)素E2(PGE2)是COX-2的主要代謝產(chǎn)物〔1〕，因此COX-2/PGE2通路是腫瘤生物治療的一個重要靶點。免疫逃逸是膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的一個重要因素，腫瘤微環(huán)境中分泌的免疫抑制因子是導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸的主要原因。主要的免疫抑制因子包括轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)以及PGE2等〔2〕。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤COX-2表達(dá)上調(diào)，與腫瘤病理級別及增殖呈正相關(guān)〔3〕。本文觀察選擇性COX-2抑制劑celecoxib阻斷COX-2/PGE2通路后對膠質(zhì)瘤細(xì)胞主要免疫抑制因子表達(dá)的影響，探索COX-2抑制劑在膠質(zhì)瘤免疫治療中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞株購自上海中國科學(xué)院生命科學(xué)研究所。RPMI1640粉劑為Gibco公司產(chǎn)品，RT-PCR試劑盒購自Takara公司，ELISA試劑盒購自晶美公司，COX-2單克隆抗體購自Santa Cruz公司，Western印跡試劑盒購于武漢博士德生物制品公司，celecoxib購自西爾公司(美國);10%小牛血清購自杭州四季青公司。

1.2 方法

1.2.1 Western印跡檢測 celecoxib作用后C6細(xì)胞COX-2表達(dá) 取對數(shù)生長期的C6細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液(2×105個細(xì)胞/ml)，按3 ml/孔接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁后，分別更換含不同濃度(0，10，25，50，100 μmol/L)celecoxib 的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，胰酶消化收獲各濃度藥物作用的細(xì)胞，加入200 μl用冰預(yù)冷的細(xì)胞裂解液制備細(xì)胞總蛋白，Bradford方法測定蛋白質(zhì)濃度。取蛋白溶液進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離，將凝膠中的蛋白電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，5%脫脂奶粉中室溫封閉1 h，隨后加入抗COX-2抗體、抗β-肌動蛋白(β-actin)抗體，4℃孵育過夜，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗，二氨基聯(lián)苯胺(DAB，0.05%)-H2O2(0.01%)顯色，對染色的蛋白質(zhì)譜帶進(jìn)行掃描分析讀取吸光度(A)，計算其與β-actin的比值。

1.2.2 RT-PCR檢測VEGF、TGF-β mRNA表達(dá) 取對數(shù)生長期的C6細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液(2×105個細(xì)胞/ml)，按3 ml/孔接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁后，更換含50 μmol/L celecoxib的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，對照組僅更換培養(yǎng)基。按照Trizol試劑說明書提取細(xì)胞總RNA，測其濃度，取總RNA 4 μg進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。PCR 反應(yīng)體系為 50 μl，擴增條件：94℃ 5 min，94℃ 30 s、55℃ 1 min、72℃ 1 min×32個循環(huán)，72℃ 10 min(引物設(shè)計見表1)。取5 μl反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察照相，凝膠成像系統(tǒng)分析灰度值，結(jié)果取目的基因條帶與βactin條帶灰度值的比值。

1.2.3 ELISA法檢測celecoxib作用C6細(xì)胞后PGE2、VEGF、TGF-β分泌水平 C6細(xì)胞的制備同 RT-PCR實驗，加入50 μmol/L celecoxib后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，離心提取C6細(xì)胞上清液，根據(jù) ELISA試劑盒說明操作，檢測細(xì)胞上清中 PGE2、VEGF、TGF-β水平，每組設(shè)3個復(fù)孔，結(jié)果取3孔均值。

表1 引物設(shè)計

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以s表示，多組均數(shù)比較采用完全隨機設(shè)計資料的方差分析。

2 結(jié)果

2.1 celecoxib對C6細(xì)胞COX-2蛋白表達(dá)的影響 celecoxib作用后可明顯下調(diào) C6細(xì)胞 COX-2蛋白表達(dá)，10、25、50、100 μmol/L組及對照組 COX-2表達(dá)量分別為 0.81±0.03、0.68±0.02、0.32 ±0.02、0.19 ±0.02、0.92 ±0.03;且隨 celecoxib濃度增加其作用更加明顯。見圖1。

圖1 不同濃度celecoxib對C6細(xì)胞COX-2表達(dá)的影響

2.2 celecoxib對 C6細(xì)胞VEGF、TGF-β mRNA表達(dá)的影響以50 μmol/L celecoxib 作用于 C6 細(xì)胞 48 h 后，VEGF、TGF-β mRNA的表達(dá)(0.65±0.67、0.58±0.49)均下調(diào)，與對照組(1.06±0.79、0.86±0.65)相比，其灰度比值明顯降低(P＜0.01)。

2.3 celecoxib對 C6細(xì)胞上清中 PGE2、VEGF、TGF-β 含量的影響 以50 μmol/L celecoxib作用于C6細(xì)胞48 h后，C6細(xì)胞上清中 PGE2、VEGF、TGF-β 水平(43.2 ±7.15、72.05 ±7.67、66.51±5.42)與對照組(95.71±14.02、116.0±12.45、104.15±10.67)比較均明顯下降(P＜0.01)。

3 討論

近年來發(fā)現(xiàn)，以樹突細(xì)胞(DC)為基礎(chǔ)的免疫治療可改善腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后，是對膠質(zhì)瘤傳統(tǒng)治療的一個重要補充。但由于腫瘤免疫逃逸現(xiàn)象的存在，極大地影響了膠質(zhì)瘤免疫治療的效果。因此，逆轉(zhuǎn)膠質(zhì)瘤免疫逃逸是改善膠質(zhì)瘤治療效果的有效途徑。膠質(zhì)瘤產(chǎn)生免疫逃逸現(xiàn)象與多種機制有關(guān)，其中一個重要機制是腫瘤微環(huán)境中可分泌大量的免疫抑制因子，包括PGE2、VEGF、TGF-β、雙加氧酶(IDO)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)、一氧化氮合酶2(NOS-2)等，均具有抑制免疫反應(yīng)的功能，影響免疫細(xì)胞對腫瘤的殺傷作用。TGF-β在膠質(zhì)瘤中具有較高的表達(dá)活性，可抑制T細(xì)胞、自然殺傷(NK)細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)B細(xì)胞及T細(xì)胞凋亡，還可抑制膠質(zhì)瘤組織相容性復(fù)合物(MHC-Ⅱ類分子)的表達(dá)以及抑制抗原提呈細(xì)胞活性〔2，4〕。TGF-β的存在可顯著促進(jìn)IL-10的分泌，IL-10能降低DC的表面分子如 MHC-Ⅱ、CD80及CD86等的表達(dá)率，抑制DC的分化成熟，抑制DC的抗原提呈能力，使其無法激活T細(xì)胞識別和殺傷腫瘤細(xì)胞，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸〔5〕。VEGF是一種34～42 kD的蛋白，可在早期影響DC前體細(xì)胞的發(fā)育分化，導(dǎo)致DC成熟障礙〔6〕。大量研究證實，COX-2在包括膠質(zhì)瘤在內(nèi)的多種惡性腫瘤中均有較高的表達(dá)水平，并影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移、血管生成〔1〕;近來還發(fā)現(xiàn)COX-2與腫瘤免疫缺陷有密切的關(guān)系〔7〕。腫瘤組織高表達(dá)的COX-2可通過其催化產(chǎn)物PGE2，導(dǎo)致抗腫瘤免疫系統(tǒng)功能缺陷，使其無法有效識別和殺傷腫瘤細(xì)胞〔8〕。PGE2可提高細(xì)胞內(nèi)cAMP水平，抑制巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、T殺傷細(xì)胞的活性，抑制干擾素(IFN)-γ、IL-1、IL-2等細(xì)胞因子產(chǎn)生，進(jìn)而抑制機體免疫反應(yīng);COX-2/PGE2可以調(diào)控TGF-β 及 VEGF 的表達(dá)〔9〕。

本課題組在前期研究中，同樣證實了COX-2在高級別膠質(zhì)瘤組織中具有較高的表達(dá)水平，并發(fā)現(xiàn)PGE2可改變DC表面分子的表達(dá)譜，使其抗原提呈能力減弱，而celecoxib可以部分逆轉(zhuǎn)這一作用。本文進(jìn)一步觀察到，celecoxib可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞COX-2的表達(dá)，使其分泌PGE2減少，并可下調(diào) TGF-β及VEGF mRNA的表達(dá)，進(jìn)而減少TGF-β、VEGF分泌。通過這一途徑，可以明顯改善膠質(zhì)瘤免疫微環(huán)境，阻斷其免疫逃逸的發(fā)生，并增強其對DC疫苗等免疫治療的效應(yīng)。進(jìn)而我們設(shè)想，celecoxib聯(lián)合DC疫苗可能會具有更好的抗腫瘤效應(yīng)，或許是提高膠質(zhì)瘤治療效果的有效途徑。

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