范曉艷 金岳雷 于 洋 李 玉 呂冬霞 (佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 54007)

毛尖蘑屬珍貴野生菌，是黑龍江省特有的食、藥用真菌，其子實體營養(yǎng)豐富，是食品、醫(yī)藥、保健品行業(yè)開發(fā)利用的寶貴資源〔1〕。真菌多糖具有增強(qiáng)免疫力、抗菌、抗病毒、抑制腫瘤、增強(qiáng)心血管功能等作用。本研究通過提取毛尖蘑子實體粗多糖(MJMP)，檢測不同濃度MJMP作用H22荷瘤小鼠后對胸腺指數(shù)、脾指數(shù)、抑瘤率的影響，為MJMP抗腫瘤作用及對免疫系統(tǒng)影響的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 H22腹水瘤小鼠，購于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院動物中心。實驗動物：昆明種近交系小鼠48只(合格證號：黑動字第99101001，清潔級)，體重(20 ±2.0)g，雄性，由佳木斯大學(xué)實驗動物中心提供(許可證號：SYXK黑2006-004)。毛尖蘑子實體，購于大興安嶺呼瑪縣韓家園林業(yè)局松濤鹿苑公司。環(huán)磷酰胺(CTX)，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。電子天平(上海恒科技有限公司)，粉碎機(jī)(溫嶺市創(chuàng)力藥材器械廠)，電熱恒溫水浴槽(余兆市遠(yuǎn)東數(shù)控儀器廠)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52A(上海亞榮生化儀器廠)，循環(huán)水式多用真空泵SHB-Ⅲ(鄭州長城科技工貿(mào)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 提取MJMP 根據(jù)文獻(xiàn)〔2〕，采用熱水浸提方法改良。

1.2.2 動物分組與用藥 選取接種H22腫瘤6 d的腹水瘤小鼠1只，放在蠟盤中斷髓法處死;浸入75%酒精溶液中消毒，浸透取出，放入無菌培養(yǎng)皿中;在超凈工作臺上用鑷子挑起腹部皮膚，針頭插入皮下抽取腹腔液5 ml，放入事先已有5 ml生理鹽水的三角燒瓶中混勻;加樣槍取10 μl放入 EP管中，再取990 μl生理鹽水放入此EP管中，混勻;用加樣槍取少量加入計數(shù)板中計數(shù)，達(dá)到7.5×106個/ml。小鼠稱重，標(biāo)記，隨機(jī)分成6組，每組8只;用75%乙醇對小鼠右腋下進(jìn)行消毒，除空白對照組外，其余各組每只右腋下皮下注射0.2 ml(含癌細(xì)胞1.5×106個)H22腹水瘤細(xì)胞懸液。第1組空白對照組，第2組生理鹽水組(陰性對照組)，第3組環(huán)磷酰胺組(陽性對照組)(20 mg/kg)，第 4組 MJMP高劑量組(400 mg/kg)，第 5組MJMP中劑量組(200 mg/kg)，第 6組 MJMP低劑量組(100 mg/kg)。接種24 h后，按不同組灌胃，第 1、2組灌服0.4 ml生理鹽水，第3組灌服0.4 ml環(huán)磷酰胺，第4、5、6組灌服MJMP溶液0.4 ml，6組動物均每日灌服一次，連續(xù)9 d。

1.2.3 MJMP對免疫系統(tǒng)重量的影響 將灌胃9 d的小鼠用斷髓法處死，快速打開胸腔取出脾、胸腺，稱重。按下列公式計算胸腺指數(shù)和脾指數(shù)：胸腺指數(shù)(mg/g)=1 000×胸腺質(zhì)量/體質(zhì)量;脾指數(shù)(mg/g)=1 000×脾質(zhì)量/體質(zhì)量。

1.2.4 MJMP對腫瘤生長的影響 將灌胃9 d的小鼠用斷髓法處死，剝離腫瘤，稱重。計算抑瘤率。抑瘤率=〔用藥組腫瘤質(zhì)量(g)－陰性對照組腫瘤質(zhì)量(g)〕/陰性對照組腫瘤質(zhì)量(g)×100%。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS11.5軟件進(jìn)行分析，計量資料用s表示，采用方差分析(AVONA)，兩兩比較用Q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)的比較 與空白對照組比較，陰性對照組及各濃度MJMP用藥組胸腺指數(shù)下降(P＜0.01);與陰性對照組相比，MJMP高、中劑量組胸腺指數(shù)上升(P＜0.01，P＜0.05)，MJMP用藥組與空白對照組及陰性對照組脾指數(shù)比較差異不明顯(P＞0.05)。見表1。

2.2 腫瘤抑制率 各濃度的MJMP對瘤體增長均有抑制效應(yīng)(P＜0.01);與陰性對照組比較，陽性對照組及MJMP高、中、低劑量組瘤重明顯降低(P＜0.01，P＜0.05);與陽性對照組比較，MJMP中、低劑量組瘤重增加(P＜0.01)，粗多糖高劑量組與陽性對照組比較，瘤重?zé)o差別(P＞0.05)。見表2。

表1 各組小鼠脾和胸腺重量指數(shù)的比較( s ，mg/g，n=8)

表1 各組小鼠脾和胸腺重量指數(shù)的比較( s ，mg/g，n=8)

與空白對照組比較：1)P＜0.01;與陰性對照組比較：2)P＜0.05，3)P＜0.01

0.008 1±0.003 1 0.002 6±0.000 9陰性對照組 0.005 8±0.001 3 0.001 0±0.000 51)MJMP高劑量組 0.006 5±0.004 8 0.001 6±0.000 91)3)MJMP中劑量組 0.006 6±0.002 3 0.001 4±0.000 91)2)MJMP低劑量組 0.006 3±0.001 2 0.001 2±0.000 31)組別 脾指數(shù) 胸腺指數(shù)空白對照組

表2 各組小鼠腫瘤抑制率( s ，n=8)

表2 各組小鼠腫瘤抑制率( s ，n=8)

與陰性對照組比較：1)P＜0.05，2)P＜0.01;與陽性對照組比較：3)P＜0.01

組別 平均瘤重(g)腫瘤抑制率(%)14.104 2 0.684 9±0.316 2陽性對照組 0.279 1±0.100 52) 59.249 5 MJMP高劑量組 0.272 6±0.129 62) 60.198 6 MJMP中劑量組 0.424 6±0.184 31)3) 38.005 5 MJMP低劑量組 0.588 3±0.21741)3)陰性對照組

3 討論

真菌多糖作為一種非特異性免疫促進(jìn)劑，正在被人們所關(guān)注，毛尖蘑是產(chǎn)在黑龍江省大、小興安嶺一帶的野生珍稀食藥用真菌，其子實體所含營養(yǎng)成分高，部分營養(yǎng)成分含量是普通蘑菇的幾倍甚至幾十倍，是黑龍江省的寶貴資源。但因為毛尖蘑的產(chǎn)量低，目前針對毛尖蘑的研究主要集中在栽培和營養(yǎng)成分分析方面。關(guān)于MJMP提取及其多糖對腫瘤細(xì)胞凋亡、機(jī)體免疫力的影響等方面的研究未見報道。

多糖的免疫調(diào)節(jié)作用也是抗腫瘤作用機(jī)制之一，與大多數(shù)藥品不同的是多糖是免疫增強(qiáng)劑〔3〕，不但能激活T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷(NK)細(xì)胞、細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞(CTL)、淋巴因子激活殺傷性細(xì)胞(LAK)等免疫細(xì)胞的活性，激活網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬、清除老化細(xì)胞和異物以及病原體的作用，調(diào)節(jié)機(jī)體抗體和補(bǔ)體的產(chǎn)生，提高機(jī)體抗腫瘤免疫力〔4〕。

本文結(jié)果顯示MJMP能夠增強(qiáng)H22荷瘤小鼠的機(jī)體免疫力，其增強(qiáng)能力與MJMP的濃度呈正相關(guān);而小鼠的脾臟對5～20 mg/ml的MJMP不敏感，此結(jié)論還有待在今后的實驗中進(jìn)一步研究證明。高、中、低濃度的MJMP對瘤體增長有抑制效應(yīng)，即MJMP能夠抑制腫瘤的生長，且抑制能力與MJMP在5～20 mg/ml的濃度范圍內(nèi)呈正相關(guān)，在本實驗中MJMP的濃度為20 mg/ml時，對腫瘤的抑制效果最好。多糖的抗腫瘤機(jī)制包括兩個方面：①多糖具有細(xì)胞毒活性，可以直接殺死癌細(xì)胞，如茯苓多糖，刺五加多糖等〔5〕。②作為生物免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，通過增強(qiáng)宿主免疫功能而直到抑制腫瘤的作用。本實驗中MJMP在抑制腫瘤生長的同時，還對小鼠的胸腺有刺激增生的作用，可初步推斷MJMP可能是通過提高小鼠機(jī)體的免疫力發(fā)揮其抗腫瘤的功效，其作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究。

1 黃 江.毛尖蘑菌株深層發(fā)酵工藝的研究〔J〕.中國林副特產(chǎn)，2003;6(2)：27.

2 范曉艷.毛尖蘑粗多糖提取方法的研究〔J〕.黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2010;33(4)：20-1.

3 楊大雷，張星星.巴西菇多糖對肝癌細(xì)胞株凋亡的影響及其機(jī)制〔J〕. 廣東醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2002;20(6)：418-19.

4 李明春，梁東升，許自明.靈芝多糖對小鼠巨噬細(xì)胞cAMP含量的影響〔J〕. 中國中藥雜志，2000;25(1)：41-3.

5 佟 麗，吳 波，黃添友，等.植物多糖抗腫瘤作用與機(jī)理研究：Ⅲ茯苓多糖(PPS)和刺五加多糖(ASPS)對S180細(xì)胞膜脂肪酸組成的影響〔J〕.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，1995;7(1)：5-9.