許 可 陳軍全 (廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 廈門 36005)

翼狀胬肉(Pterygium)是一種常見的眼表疾病，發(fā)病后可向中央角膜區(qū)移行，最終導(dǎo)致失明。與靜止型的翼狀胬肉相比，進(jìn)展型的翼狀胬肉表現(xiàn)出很強(qiáng)的向角膜中央?yún)^(qū)遷移的特點(diǎn)?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)可以降解細(xì)胞外基質(zhì)(Eam)從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移;在翼狀胬肉中已發(fā)現(xiàn)MMP-1、MMP-2、MMP-7、MMP-8、MMP-9 的表達(dá)上調(diào)〔1〕。在一些病理過程中，細(xì)胞分泌MMPs的同時(shí)也分泌MMPs特異性抑制因子(TIMPs)。殼寡糖是殼聚糖部分降解的產(chǎn)物，已有研究發(fā)現(xiàn)殼六糖可以產(chǎn)生明顯的腫瘤抑制作用，當(dāng)濃度為10 mg/kg時(shí)作用最強(qiáng)〔2〕。不僅如此，殼六糖對(duì)抑制腫瘤轉(zhuǎn)移也表現(xiàn)出良好效果〔3〕。

1 材料與方法

1.1 材料 殼六糖購自大連中科格萊克生物技術(shù)有限公司，MMP-9和TIMP-1單克隆抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司。翼狀胬肉由昆明第一醫(yī)院提供。根據(jù)翼狀胬肉的組織形態(tài)學(xué)特性，將其分為靜止型(n=29)和進(jìn)展型(n=20)。同時(shí)統(tǒng)計(jì)每個(gè)翼狀胬肉組織對(duì)應(yīng)患者的年齡、性別等信息。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化 將新鮮的翼狀胬肉組織切成均勻的兩部分，一份用4%多聚甲醛固定后櫻花冷凍包埋劑(OCT)包埋切片。切片厚度為6 μm。冰凍切片用4%多聚甲醛處理10 min，0.3%H2O2處理10 min消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次后，用0.2%Triton X-100孵育15 min。PBS洗3次后，用2%牛血清白蛋白(BSA)封閉30 min。加一抗MMP-9(1∶50)4℃過夜孵育，加入二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒中對(duì)應(yīng)的二抗，最后DAB顯色。光鏡下觀察后，用清水沖洗，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。

1.2.2 翼狀胬肉原代細(xì)胞培養(yǎng) 取翼狀胬肉組織塊，利用添加雙抗的PBS液浸泡15 min，PBS清洗2遍(每遍浸泡5 min)備用。用解剖剪將其剪成1～2 mm左右的小塊。這些小組織塊用SHEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、5%(V/V)CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。2 d更換一次培養(yǎng)液。細(xì)胞貼壁生長近80%后，棄培養(yǎng)液，用PBS清洗后加入適量的胰酶消化。待貼壁細(xì)胞變圓后，加培養(yǎng)液終止，并離心收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)?！埠罄m(xù)研究均在MMP-9陽性表達(dá)的進(jìn)展型翼狀胬肉組織培養(yǎng)的血管周上皮樣細(xì)胞(PECs)中進(jìn)行〕。

1.2.3 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 消化PECs細(xì)胞后，用PBS清洗離心，細(xì)胞懸浮于無血清的SHEM培養(yǎng)液中。5×104個(gè)細(xì)胞接種于Transwell小室，每孔100 μl。設(shè)空白對(duì)照組(PBS)和不同濃度的殼六糖樣品組，下室加入體積分?jǐn)?shù)為10% 新生牛血清的SHEM培養(yǎng)液。置37℃、5%(V/V)CO2的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)液，4%多聚甲醛4℃固定30 min，無菌水輕柔洗2次。用姬姆薩染料染色30 min后，用棉棒將膜上的細(xì)胞擦去，輕柔水洗，在顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)。

1.2.4 RNA提取和cDNA合成 接種2.5×105個(gè)/ml的PECs細(xì)胞于6孔板中，每孔2 ml，分別以終濃度100 μg/ml殼六糖和PBS處理48 h后收集細(xì)胞，用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA。獲得的總RNA，以20 μl焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解。紫外吸收法測(cè)定總RNA在吸光度260 nm和280 nm處吸收值，并計(jì)算其濃度和純度。吸取總 RNA 2 μg，按 Invitrogen公司MMLV First Strand cDNA Synthesis Kit說明書合成 cDNA，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 Real-time PCR 通過美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)查找人源的 MMP-9、TIMP-1、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因，采用Premier5.0軟件設(shè)計(jì)引物序列(表1)。Realtime PCR檢測(cè) MMP-9、TIMP-1、GAPDH基因表達(dá)水平。采用Bio-Rad IQTM5儀進(jìn)行測(cè)定。GAPDH和 MMP-9、TIMP-1的PCR 反應(yīng)體系均為 20 μl，上、下游引物(10 μmol/L)各 0.5 μl，cDNA(稀釋 5 倍)1 μl，2 × SYBR premixture 10 μl，用去離子水(ddH2O)補(bǔ)至20 μl。反應(yīng)條件為95 ℃ 10 min，95 ℃變性15 s，55℃退火1 min，共40個(gè)循環(huán)。

表1 Real-time PCR引物序列

1.2.6 Western印跡 取1×106個(gè)翼狀胬肉原代細(xì)胞在100 mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h，分別以100 μg/ml殼六糖和PBS作用48 h后，收集細(xì)胞提取蛋白，取含有50 μg總蛋白的細(xì)胞裂解產(chǎn)物進(jìn)行8%十二烷基硫酸鈉-聚酰氨乙烯凝膠(SDS-PAGE)電泳，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移到聚氟偏乙烯(PVDF)膜上，用含有5%脫脂奶粉的Tris鹽酸緩沖液(TBST)溶液封閉PVDF膜1 h后，加入 TIMP-1(1∶100)和 MMP-9(1∶200)，4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次15 min，二抗稀釋液(1∶5 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次15 min，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)資料以s表示，采用χ2檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果

2.1 MMP-9在翼狀胬肉中的表達(dá) MMP-9在翼狀胬肉上皮細(xì)胞中表達(dá)，并且在胞核和細(xì)胞質(zhì)都有表達(dá)。在49例翼狀胬肉組織中，19例(38.78%)陽性表達(dá)，30例(61.22%)陰性表達(dá)。MMP-9陽性表達(dá)者年齡〔(65.7±8.2)歲〕與陰性表達(dá)者年齡〔(61.3±6.3)歲〕無顯著差異(P＞0.05)。MMP-9陽性表達(dá)中女性8例(42.11%)，男性11例(57.89%)(P＞0.05)。同時(shí)，陰性表達(dá)標(biāo)本中女性 17例(56.67%)，男性 13例(43.33%)，亦無顯著差異(P＞0.05)。進(jìn)展型翼狀胬肉占陽性表達(dá)標(biāo)本總數(shù)的78.95%。而處于靜止期的翼狀胬肉標(biāo)本主要集中于MMP-9陰性組(86.21%)。見圖1。

2.2 殼六糖對(duì)翼狀胬肉原代細(xì)胞遷移能力的影響 殼六糖濃度為 0、10、50、100、500、1 000 μg/ml時(shí)，PECs 遷移能力分別為1.02±0.14、0.9 ±0.16、0.7 ±0.08、0.46 ±0.08、0.41 ±0.03、0.42±0.08。10～1 000 μg/ml區(qū)間內(nèi)殼六糖對(duì)PECs遷移力的抑制效果表現(xiàn)出劑量依賴性的特點(diǎn)。并且當(dāng)殼六糖終濃度為1 000 μg/ml時(shí)，對(duì)PECs遷移能力表現(xiàn)出顯著抑制。

2.3 在PECs中殼六糖對(duì)MMP-9、TIMP-1 mRNA水平的影響對(duì)照組 MMP-9、TIMP-1 mRNA分別為 1.04±0.11、1.14±0.13，殼六糖處理后的 PECs中 MMP-9 mRNA水平(0.41±0.07)顯著下調(diào)，TIMP-1 mRNA水平(2.24±0.19)顯著上調(diào)。Western印跡技術(shù)檢測(cè)同樣發(fā)現(xiàn)，殼六糖處理后的 PECs中MMP-9蛋白水平下調(diào)，TIMP-1蛋白表達(dá)顯著上調(diào)。見圖2。

圖1 免疫細(xì)化檢測(cè)翼狀胬肉組織中MMP-9表達(dá)

圖2 Western印跡檢測(cè)100 μg/ml殼六糖處理后MMP-9、TIMP-1蛋白水平

3 討論

翼狀胬肉發(fā)病機(jī)制至今仍不十分清楚，但遷移相關(guān)的基因在翼狀胬肉組織中陽性表達(dá)暗示遷移可能與其發(fā)病有關(guān)。殼六糖具有很好的生物活性，在抑制腫瘤發(fā)生和惡化方面的表現(xiàn)尤為突出，并且無明顯的毒副作用。Shen等〔3〕在進(jìn)行胃腺癌細(xì)胞系A(chǔ)GS、結(jié)腸癌細(xì)胞系COLO205、肝癌細(xì)胞系HepG2的研究中發(fā)現(xiàn)殼六糖具有抑制腫瘤細(xì)胞遷移的作用?；谝陨蠋c(diǎn)，本文開展了殼六糖對(duì)翼狀胬肉的研究。到目前為止，翼狀胬肉沒有公認(rèn)的動(dòng)物模型，因此以細(xì)胞模型作為研究對(duì)象，選擇翼狀胬肉病變程度高的組織塊進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)。為避免人為因素的影響，挑選MMP-9(翼狀胬肉發(fā)病相關(guān)基因)陽性表達(dá)的進(jìn)展型翼狀胬肉組織樣品進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)劑量達(dá)到100 μg/ml時(shí)，殼六糖可有效抑制翼狀胬肉原代上皮細(xì)胞(即PECs)的遷移。

MMPs是一類鋅離子依賴的蛋白水解酶，可以水解ECM，在腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和血管生成等多種病理過程中發(fā)揮著重要作用。近來發(fā)現(xiàn)，其成員之一的MMP-9在翼狀胬肉中表達(dá)，在正常結(jié)膜和角膜緣處不表達(dá)〔4〕;同時(shí)，構(gòu)成角膜上皮細(xì)胞基底膜成分的Ⅳ型膠原可以被MMP-9降解〔4〕。因此，推測(cè)殼六糖的作用可能和MMP-9的表達(dá)有一定關(guān)系。本研究結(jié)果表明，殼六糖確實(shí)抑制了MMP-9的表達(dá)。這與van Quang等〔5〕在人纖維肉瘤細(xì)胞HT1080中的發(fā)現(xiàn)一致。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，MMP-9主要在遷移能力增強(qiáng)的進(jìn)展型翼狀胬肉中陽性表達(dá)，殼六糖可能通過抑制MMP-9的表達(dá)從而具備抑制翼狀胬肉發(fā)展的功效。TIMPs是MMPs的主要抑制劑，其中TIMP-1在大部分的翼狀胬肉組織中表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)殼六糖可以促進(jìn)TIMP-1的表達(dá)。有報(bào)道提到TIMP-1是MMP-9的特異性抑制劑〔6〕。本文的結(jié)果似乎表明在PECs上同樣存在這種關(guān)系，同時(shí)，MMP-9還可刺激血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá)。通過對(duì)MMP-9和TIMP-1的作用，殼六糖可能不僅抑制基底膜的降解，阻止翼狀胬肉遷移;同時(shí)參與抑制一些因子如VEGF(它可引起血管向角膜區(qū)長入〔7，8〕)的分泌。這一切都提示殼六糖可用于翼狀胬肉治療。

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