王 鵬 許 潔 安思訓(xùn) 于 順 何 欣

(北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，吉林 吉林 132013)

帕金森病(PD)以路易小體(LB)和路易軸索(LN)的形成為主要病理特征。多項研究證實LB和LN可導(dǎo)致黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性壞死，α-突觸核蛋白(α-Syn)的變性聚集是形成LB和LN的關(guān)鍵。α-Syn與神經(jīng)元內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，參與突觸形成、維持和神經(jīng)元的分化，參與突觸可塑性。在多巴胺能神經(jīng)元中，α-Syn分布于胞體和軸突中，軸突中分布較胞體更為密集。在PD中，α-Syn作為LB和LN的主要成分也存在于細(xì)胞間。α-Syn功能片段包括N端(1～60)，含有兩個PD突變位點(30＆53);NAC段，第61～95位氨基酸，已被確定是 Syn淀粉樣變和纖維化過程重要片段;C端(96～140)，包含α-Syn家族特征性信息，可促進(jìn)微管蛋白在體外合成微管〔1〕。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，α-Syn可以增加神經(jīng)元培養(yǎng)初期的存活率。本實驗擬觀察各片段對神經(jīng)元生長的影響，旨在確定具有提高原代神經(jīng)元存活率的片段，探討α-Syn促進(jìn)神經(jīng)元生長的作用機制和PD的發(fā)病機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 馬血清(HS)和胎牛血清(FBS)，購自Hy-Clone;蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，購自Pharmacia公司;蛋白質(zhì)定量試劑盒BCA Protein Assay Kit，購自Pierce Biotech;FITC標(biāo)記的羊抗鼠抗體，購自中山公司;細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM(F-12)，購自Gibco公司;α-Syn單克隆抗體及各片段的單克隆抗體，由首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)生物學(xué)研究室制備。其他均為化學(xué)分析純。

1.2 實驗動物 新生24 h的Wistar大鼠，不限雌雄，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，許可證號：SCXK-(軍)。

1.3 方法

1.3.1 蛋白的純化與定量 實驗所用重組蛋白α-Syn、NAC段(61～95)、N端(1～60)、C端(96～140)，采用親和層析法進(jìn)行純化。SDS-PAGE法鑒定，BCA法定量。

1.3.2 原代神經(jīng)元培養(yǎng) 采用改良的原代培養(yǎng)方法〔2〕。新生24 h Wistar大鼠斷頭，取出鼠腦，置于D-Hank緩沖液中清洗，去除血管和腦膜，將皮質(zhì)與髓質(zhì)分離并剪成小塊。以胰酶消化45 min，吹散并以篩網(wǎng)過濾。800 r/min離心2 min，棄上清，沉淀置于DMEM培養(yǎng)基中，混勻，并計數(shù)細(xì)胞密度。按0.75×105個/皿接種在培養(yǎng)皿中，加入相應(yīng)蛋白進(jìn)行分組培養(yǎng)。

1.3.3 神經(jīng)元生長情況觀察 培養(yǎng)至第1、2、4小時，在培養(yǎng)皿中加入終濃度為1%的戊二醛，固定1 h。隨機挑選30個視野(每個視野有5個以上存活的神經(jīng)元)，相差顯微鏡下觀察并進(jìn)行拍照。

1.3.4 Western印跡法鑒定 棄去培養(yǎng)基，緩沖液沖洗。用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，進(jìn)行超聲破碎，功率200 W，破碎30 s 2次，間歇30 s。破碎后加入 SDS-PAGE緩沖液，煮沸 5 min。4℃，12 000 r/min，離心20 min。轉(zhuǎn)移上清，取35 μl作為樣品，進(jìn)行SDS-PAGE。結(jié)束電泳后，轉(zhuǎn)膜，封閉，沖洗后，以1∶800比例稀釋的相應(yīng)抗體反應(yīng)過夜。洗膜，再與1∶5 000稀釋的生物素標(biāo)記的羊抗鼠抗體溶液反應(yīng)。沖洗后，ECL法顯示條帶。

1.3.5 免疫熒光法鑒定 室溫下以戊二醛將培養(yǎng)細(xì)胞固定1 h，PBS沖洗。以含10%羊血清的PBST室溫下封閉1 h。棄去封閉液，加入1∶5 000稀釋的各片段抗體1.5 ml。4℃過夜后PBST沖洗。加入1∶500稀釋的FITC標(biāo)記羊抗鼠抗體，37℃2 h;吸棄反應(yīng)液，沖洗。熒光顯微鏡下觀察并照相。

1.3.6 培養(yǎng)分組方案 向培養(yǎng)基中添加N端、NAC段、C端和α-Syn，終濃度為20 μmol/L，同時用未添加蛋白作為對照組。設(shè)計濃度梯度，在培養(yǎng)集中加入20、40、60 μmol/L的各蛋白，觀察在相關(guān)蛋白濃度增加后神經(jīng)元生長的變化。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS12.0軟件進(jìn)行正態(tài)性檢驗。多組樣本均數(shù)比較采用方差分析，方差齊者兩兩比較采用LSD檢驗，方差不齊者用TamhanepT2檢驗。兩組比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 蛋白純化鑒定 經(jīng)SDS-PAGE鑒定，經(jīng)親和層析得到純度較高的α-Syn和NAC、N端和C端。見圖1。

圖1 純化后蛋白SDS-PAGE電泳圖

2.2 C端提高原代培養(yǎng)神經(jīng)元存活率，NAC段、N端對神經(jīng)元生長無影響 見圖2。培養(yǎng)至1、2 h，添加α-Syn組和C端組的神經(jīng)元存活率大于對照組，N端組、NAC段組與對照組無差異(P＜0.05)。培養(yǎng)至4 h，α-Syn組神經(jīng)元存活率明顯大于對照組(P＜0.01)，C端組大于對照組(P＜0.05)，而N端組、NAC與對照組相比無差異(P＞0.05)。添加不同濃度的蛋白，培養(yǎng)至1、2、4 h，α-Syn組和C端組神經(jīng)元存活率隨蛋白濃度的增加而增加(P＜0.05)，而對照組和N端組、NAC組未見差異(P＞0.05)?？梢奀端具有與α-Syn相似的促原代神經(jīng)元生長的功能，NAC段和N端無促突起生長功能。

圖2 α-Syn和其功能片段對神經(jīng)元突起生長的影響

2.3 增加蛋白片段C端的濃度，神經(jīng)元的存活率提高 C端和N端能進(jìn)入神經(jīng)元，NAC段不能進(jìn)入神經(jīng)元。α-Syn組Western印跡結(jié)果可見清晰條帶;N端組和C端組為弱陽性;對照組、NAC段組未見條帶，陰性。免疫熒光顯示，α-Syn組和C端組、N端組神經(jīng)元顯色清晰，NAC段組和對照組為陰性。見圖3。

圖3 α-Syn向細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運

3 討論

原代培養(yǎng)的神經(jīng)元經(jīng)胰酶消化加機械吸打分離，其突起與胞體分離。破損的神經(jīng)元細(xì)胞膜可自行愈合，添加入培養(yǎng)基中培養(yǎng)，開始貼壁生長。在培養(yǎng)基中添加α-Syn可以提高原代培養(yǎng)神經(jīng)元的存活率，其可能的機制是它能夠促進(jìn)微管蛋白的聚合形成微管，微管系統(tǒng)鋪助突起生長〔3～5〕，促進(jìn)原代神經(jīng)元在培養(yǎng)皿中貼壁生長。在原代神經(jīng)元培養(yǎng)基內(nèi)添加目的蛋白進(jìn)行分組培養(yǎng)，證明在α-Syn中具有促神經(jīng)元生長功能的片段是其C端，而N端和NAC段沒有這一功能。而C端的促神經(jīng)元生長的效應(yīng)較α-Syn全長差。在培養(yǎng)基中增加C端的濃度，神經(jīng)元的存活率升高，且具有濃度依賴關(guān)系。C端和N端可由培養(yǎng)基進(jìn)入神經(jīng)元中，而NAC段不能進(jìn)入神經(jīng)元中。

在α-Syn的功能片段中，C端可以進(jìn)入神經(jīng)元內(nèi)并提高原代培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞的存活率，增加其濃度可增高這一效應(yīng)。N端可進(jìn)入神經(jīng)元，但不具備有促神經(jīng)元生長功能。而NAC段不能進(jìn)入神經(jīng)元，也無促神經(jīng)元生長功能。其可能的機制在于α-Syn C端含有眾多帶負(fù)電荷的氨基酸〔6，7〕，易與疏水基團(tuán)結(jié)合，會以某種穿梭機制進(jìn)入細(xì)胞并促進(jìn)其生長。在PD中NAC已確定是淀粉樣變和纖維化過程中不可缺少的，其73～83位氨基酸被認(rèn)為是發(fā)生聚合的關(guān)鍵部位。本研究結(jié)果證實了α-Syn促原代神經(jīng)元生長功能的功能片段位于蛋白的C端，確定了其劑量-效應(yīng)關(guān)系，N端和NAC段無這一功能，為進(jìn)一步解釋PD的發(fā)生提供了新證據(jù)。

1 Alim MA，Hossain MS，Arima K.Tubulin seeds synuclein fibril formation〔J〕.Biol Chem，2002;277：2112-7.

2 鄧小云，楊 眉，蔡 芳，等.一種改進(jìn)的原代神經(jīng)元的制備方法〔J〕.激光生物學(xué)報，2005;4(2)145-9.

3 Meloni MA，Galleri G，Camboni MG.Modeled microgravity affects motility and cytoskeletal structures〔J〕.Gravit Physiol，2004;11(2)：P197-8.

4 劉光偉，王 鵬.α-突觸核蛋白促進(jìn)大鼠原代培養(yǎng)神經(jīng)元突起生長〔J〕. 首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2009;30(5)：607-10.

5 Muhammad Abdul Alim，Qiu-lan Ma，Kazuya Takeda.Demonstration of a role for synuclein as a functional microtubule-associated protein〔J〕.J Alzheimer's Dis，2004;6：435-42.

6 Bussell R Jr，Eliezer D.A structural and functional role for 112mer repeats in alpha-synuclein and other exchangeable lipid binding proteins〔J〕.J Mol Biol，2003;329：763-78.

7 Keun JA，Seung RP，Kwang CC，et al.Amino acid sequence motifs and mechanistic features of the membrane translocation of α-synuclein〔J〕.J Neurochem，2006;97：265-79.