王若立 陳 晨 羅 紅 孫文平 楊 光 (大連市友誼醫(yī)院，遼寧 大連 600)

叉頭轉(zhuǎn)錄因子(FoxO3a)屬于轉(zhuǎn)錄因子FoxO家庭的成員，在維持免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)上發(fā)揮重要作用〔1，2〕。FoxO3a基因缺失導(dǎo)致小鼠T細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB活性增高，引起T細(xì)胞自發(fā)性增殖和多組織器官的慢性炎性細(xì)胞浸潤〔3〕。慢性炎性病變局部主要以單核巨噬細(xì)胞浸潤為主，產(chǎn)生大量炎性趨化因子誘導(dǎo)炎性細(xì)胞進(jìn)一步浸潤。目前關(guān)于FoxO3a是否參與單核巨噬細(xì)胞的分化及功能調(diào)控尚不十分清楚。本研究探討FoxO3a基因缺失對(duì)于巨噬細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1(Mac-1+)細(xì)胞分化及功能的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 FoxO3a基因敲除鼠由日本長壽醫(yī)療研究中心提供，所有小鼠均為C57BL/6品系?；蚯贸蟮慕⒁娢墨I(xiàn)〔4〕。所有實(shí)驗(yàn)均選取適齡雌性小鼠。對(duì)照小鼠均為與基因敲除鼠同窩出生的野生型鼠。所有小鼠在無特定病原體(SPF)級(jí)動(dòng)物室飼育，實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵守動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理要求。

1.2 方法

1.2.1 脾細(xì)胞制備 頸椎脫臼處死小鼠，取脾臟放入4℃Hank液(Sigma公司)中，置于100 μm無菌細(xì)胞過濾網(wǎng)(BD Falcon公司)，用注射器針芯研壓脾臟，獲得脾細(xì)胞懸液，離心后棄上清，加入紅細(xì)胞裂解液(EDTA-NH4Cl)置于冰上1 min，立即用10%胎牛血清(FBS)RPMI培養(yǎng)液(Gibco公司)洗滌細(xì)胞2次后，將細(xì)胞懸浮于10%FBS RPMI培養(yǎng)液中。所有離心條件均為 1 200 r/min，5 min。

1.2.2 細(xì)胞染色 取脾細(xì)胞3×105，分別用異硫氰酸熒光素(FITC)-anti-CD8(53-6.7)和聚乙烯熒光素(PE)-anti-CD4(RM4-5)、FITC-anti-B220(RA3-6B2)和 PE-anti-CD3(17A2)及FITC-anti-B220(RA3-6B2)和PE-anti-CD11b(M1/70)三組抗體進(jìn)行染色，用含0.05%NaN3及4%FBS的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞2次，用40 μm Nylon Mesh(BD Falcon公司)過濾后，將細(xì)胞懸浮于含5 μg/ml碘化丙啶(PI，Sigma公司)的上述緩沖液中，以上抗體均購自美國BD Pharmingen公司。用流式細(xì)胞儀FACSCalibur(美國BD Biosciences公司)對(duì)染色后細(xì)胞進(jìn)行分析。

1.2.3 細(xì)胞分選 收集40×107個(gè)脾細(xì)胞，用FITC-anti-B220(RA3-6B2)和PE-anti-CD4(RM4-5)抗體染色后，使用日本Bay Bioscience JSAN流式細(xì)胞分選儀獲得CD4+T細(xì)胞和B細(xì)胞，純度分別為98.5%和98.7%?；厥瘴粗炯?xì)胞，用FITC-anti-B220(RA3-6B2)和PE-anti-CD11b(M1/70)抗體染色后，使用上述分選儀獲得Mac-1+細(xì)胞，純度為99%?；厥瘴粗炯?xì)胞，用FITC-anti-CD8(53-6.7)和PE-anti-CD4(RM4-5)抗體染色后，使用上述分選儀獲得CD8+T細(xì)胞，純度為98.7%。

1.2.4 RNA提取及Real-time PCR 取1×107個(gè)細(xì)胞，用PBS洗滌2次，溶于1 000 μl TRIzol Reagent(Invitrogen公司)中，提取總RNA。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega公司)合成cDNA。使用QuantiTect SYBR Green PCR Kit(QIAGEN公司)對(duì)目標(biāo)基因mRNA表達(dá)進(jìn)行定量。S100A8上游引物：5'-ATACAAGGAAATCACCATGC-3';下游引物：5'-TACTCCTTGTGGCTGTCTTT-3';S100A9上游引物：5'-AGCAAGAAGGAATTCAGACA-3';下游引物：5'-TCAGCATCATACACTCCTCA-3';EF1a上游引物：5'-TGCTGCCATTGTTGATATGG-3';下游引物：5'-TCCACAGCTTTGATGACACC-3'。PCR條件為：95℃預(yù)變性10 min;95℃ 15 s，55℃ 25 s，72℃ 10 s，40 個(gè)循環(huán);72℃ 延伸 5 min，結(jié)束反應(yīng)，4℃保存。

1.2.5 Western印跡 取1×107個(gè)脾細(xì)胞，用冷PBS洗滌2次，溶解于 500 μl IP Kinase 液(150 mmol/L Nacl，2.5 mmol/L EGTA，1 mmol/L EDTA，50 mmol/L HEPES，0.1%Tween-20，10%glycerol)中，經(jīng)超聲波破碎后獲得脾細(xì)胞溶解液，使用BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒(Thermo Pierce公司)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量。等量樣品進(jìn)行7.5%和12.5%十二烷基硫酸鈉-聚乙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Millipore公司)。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗Anti-FOXO(Upstate 公司#06-951，1∶1 500)或 Anti-S100A9(abcam 公司 ab75478，1∶1 000)，4℃過夜。用含 0.05%Tween-20的 PBS溶液洗滌 3次各 10 min后加入二抗 Anti-rabbit(Sigma，1∶4 000)，室溫孵育30 min，再用上述PBS溶液洗滌3次，最后使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)發(fā)光試劑盒(Thermo Pierce公司)和X光膠片(柯達(dá)公司)顯色。一抗還包括Anti-tubulin(Sigma T6557，1∶2 000)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 FoxO3a基因缺失導(dǎo)致小鼠脾臟中Mac-1+細(xì)胞數(shù)明顯增加 基因敲除鼠的肺及皮下等組織內(nèi)可見大量炎性細(xì)胞浸潤，脾臟隨年齡增加而明顯肥大。流式細(xì)胞術(shù)分析。發(fā)現(xiàn)FoxO3a基因敲除鼠脾細(xì)胞總數(shù)明顯增加(P＜0.05)，其中T、B淋巴細(xì)胞表現(xiàn)了相同比例的增加(P＜0.05)，而Mac-1+細(xì)胞數(shù)量及百分率的增加更加明顯(P＜0.05)。見表1。

表1 FoxO3a基因敲除鼠與野生型小鼠脾細(xì)胞構(gòu)成比較(s)

表1 FoxO3a基因敲除鼠與野生型小鼠脾細(xì)胞構(gòu)成比較(s)

與野生型組比較：1)P＜0.05

組別 總數(shù)(×106)CD3+(%)B220+(%)Mac-1+(%)計(jì)數(shù)(×106)CD3+ B220+ CD4+ CD8+ Mac-1+1±2.7 8.3±2.5 4.6±2.0基因敲除組 148±14.01) 31±5.0 38±6.4 14±4.91) 45±5.31) 57±111) 22±4.21) 17±2.21) 20±71)野生型組 61±17.0 37±3.5 46±1.3 7.3±1.0 22±4.9 28±8.1 1

2.2 Mac-1+細(xì)胞內(nèi)炎性細(xì)胞因子S100A8和S100A9基因表達(dá)明顯高于對(duì)照鼠 利用流式細(xì)胞分選技術(shù)從各組小鼠脾細(xì)胞中獲得高純度的Mac-1+細(xì)胞，純度達(dá)到99%。Real-time PCR結(jié)果顯示基因敲除鼠脾臟Mac-1+細(xì)胞內(nèi)的S100A8和S100A9 mRNA表達(dá)(9.34±1.31，11.5±1.12)分別是野生型小鼠(1.36±0.31，1.00±0.08)的6.87、11.5 倍，明顯高于對(duì)照鼠。

2.3 FoxO3a基因敲除鼠脾臟S100A8、S100A9蛋白表達(dá)明顯高于正常對(duì)照鼠 由于脾細(xì)胞中S100A8和S100A9僅在Mac-1+細(xì)胞中表達(dá)，分別制備了FoxO3a基因敲除鼠及對(duì)照鼠的脾細(xì)胞溶解液?；蚯贸筝^野生型鼠S100A8(9.86±1.33 vs 1.02±0.27)和S100A9基因(8.78±1.31 vs 1.14±0.10)分別高出9.86、8.78倍。Western印跡分析顯示基因敲除鼠脾細(xì)胞中S100A8、S100A9的蛋白表達(dá)亦明顯增加。在脾細(xì)胞各組份中，僅有Mac-1+細(xì)胞表達(dá)S100A8及S100A9基因?；蚯贸笃⒓?xì)胞、野生型鼠Mac-1+細(xì)胞和基因敲除鼠Mac-1+細(xì)胞的S100A9 mRNA表達(dá)(8.78±1.31、2.81±0.22、32.33±3.15)分別為野生型小鼠脾細(xì)胞S100A9 mRNA檢出量(1.14±0.10)的8.78、2.91、31.9倍，而其他各細(xì)胞組分的檢出量近似于0。同時(shí)，基因敲除鼠脾細(xì)胞、野生型小鼠Mac-1+細(xì)胞和基因敲除鼠Mac-1+細(xì)胞的 S100A8 mRNA表達(dá)(9.86±1.33、13.25±12.74、90.82±30.98)分別為野生型小鼠脾細(xì)胞S100A8 mRNA檢出量(1.02±0.27)的9.86、13.5和87.6倍，而其他各細(xì)胞組分的檢出量接近于0。見圖1。

圖1 小鼠脾細(xì)胞中S100A8及S100A9蛋白表達(dá)

2.4 S100A8和S100A9基因啟動(dòng)子部位未發(fā)現(xiàn)已知的FoxO的DNA特異性識(shí)別序列 由于FoxO3a基因缺失導(dǎo)致Mac-1+細(xì)胞中S100A8和S100A9 mRNA的表達(dá)異常升高，為了明確FoxO3a是否直接參與S100A8和S100A9基因的表達(dá)調(diào)控，對(duì)小鼠S100A8和S100A9基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游500 bp的基因序列進(jìn)行分析，未發(fā)現(xiàn)有DNA識(shí)別序列〔(G/C)(T/A)AAA(C/T)AA〕，僅顯示了小鼠S100A8基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游91 bp序列和S100A9基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游80 bp序列。見圖2。

圖2 小鼠S100A8及S100A9基因啟動(dòng)子序列分析

3 討論

最近有報(bào)道顯示在特異性免疫應(yīng)答過程中FoxO3a參與樹突細(xì)胞的功能調(diào)控〔5〕，F(xiàn)oxO3a基因缺失可以導(dǎo)致樹突細(xì)胞過度活化產(chǎn)生大量IL-6進(jìn)而誘導(dǎo)T細(xì)胞過度增殖。還有研究發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的標(biāo)志性基因Foxp3為FoxO靶基因，F(xiàn)oxO基因缺失可導(dǎo)致Foxp3的表達(dá)抑制，使調(diào)節(jié)性T細(xì)胞發(fā)育障礙，數(shù)量減少〔1，2〕。此外還有證據(jù)顯示FoxO3a可參與淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞的凋亡調(diào)控〔6〕?？梢姡現(xiàn)oxO家族在免疫系統(tǒng)功能調(diào)控中具有重要作用。

FoxO3a基因缺失引起多種免疫細(xì)胞(效應(yīng)性T細(xì)胞、樹突細(xì)胞及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞)功能異常，可能是導(dǎo)致小鼠T細(xì)胞自發(fā)性活化增殖以及多器官慢性炎性細(xì)胞浸潤的重要原因。然而，目前普遍認(rèn)為單核巨噬細(xì)胞在慢性炎癥性疾病中發(fā)揮更為重要的作用〔7〕。慢性炎性病變局部主要以單核巨噬細(xì)胞浸潤為主，其產(chǎn)生大量炎性趨化因子可以持續(xù)誘導(dǎo)炎性細(xì)胞浸潤?；蛐酒治鲲@示，人單核細(xì)胞進(jìn)入局部組織向巨噬細(xì)胞分化過程中FoxO3a的表達(dá)降低〔8〕，提示FoxO3a可能在單核巨噬細(xì)胞的分化過程中發(fā)揮重要作用。FoxO3a基因敲除鼠表現(xiàn)的炎性反應(yīng)局部明顯的Mac-1+細(xì)胞增加，亦提示FoxO3a可能參與單核巨噬細(xì)胞的功能調(diào)控。另外，F(xiàn)oxO3a基因缺失小鼠脾臟內(nèi)Mac-1+細(xì)胞中S100A8和S100A9基因表達(dá)增高，提示FoxO3a可能有抑制單核巨噬細(xì)胞過度活化、維持其穩(wěn)態(tài)的作用，或者與S100A8和S100A9的基因表達(dá)調(diào)控有關(guān)。盡管小鼠S100A8和S100A9基因啟動(dòng)子部位尚未發(fā)現(xiàn)已知的FoxO的DNA特異性識(shí)別序列，但由于FoxO還可以通過與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)，因此，并不能排除S100A8和S100A9為FoxO3a靶基因的可能，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

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