王 穎 張桂芳 常詠涵 姚 笛 (黑龍江八一農(nóng)墾大學食品學院，黑龍江 大慶 6339)

糖尿病已經(jīng)成為現(xiàn)代社會中的一種發(fā)病率極高的疾病，并發(fā)癥頗多，近年來發(fā)病率上升很快，嚴重影響患者生存質(zhì)量，并造成極重的社會負擔〔1〕。臨床上常用的治療糖尿病的西藥毒副作用較多，尋找更為有效、安全和廉價的降糖藥物成現(xiàn)代醫(yī)學的重要任務?？喙线邦愇镔|(zhì)有快速降糖，調(diào)節(jié)胰島功能，修復β細胞，增加胰島素的敏感性，預防改善并發(fā)癥，調(diào)節(jié)血脂，提高免疫力的作用。為進一步驗證其功效，本實驗通過灌喂不同劑量的苦瓜甙來研究其對四氧嘧啶糖尿小鼠的降血糖作用和機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 昆明小鼠，雄性，體重20～25 g，自由攝食飲水，所用飼料為標準鼠飼料，由長春生物制品廠提供。

1.2 實驗材料及試劑 苦瓜甙(本實驗室制備)，實驗前用蒸餾水配制成所需濃度;格列本脲(國藥準字H11020883，北京太洋藥業(yè)有限公司);四氧嘧啶(ALX，上海億欣生物科技有限公司);怡成血糖測試儀及測定試紙(北京怡成生物電子技術(shù)有限公司);丙二醛(MDA)測定試劑盒，超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒和還原性谷胱甘肽(GSH)測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究院，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 ALX誘導小鼠糖尿病模型的建立方法 取小鼠50只適應性喂養(yǎng)1 w后，隨機抽取10只作為正常對照組，其余40只隨機分為4組(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組)，每組10只，作為ALX誘導糖尿病模型組。糖尿病模型組小鼠禁食不禁水12 h后，腹腔注射ALX，以生理鹽水配制成2%溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用)，每日1次，連續(xù)注射4 d，劑量分別為120，100，80 mg/kg和60 mg/kg。正常對照組注射等量生理鹽水。糖尿病誘導期間，分別在第2天，第3天和第4天注射4 h后，進行尾部靜脈采血，測空腹血糖值，觀察血糖升高情況，末次注射72 h后測空腹血糖值，方法參照文獻〔2〕，選取空腹血糖值≥11.1 mmol/L的小鼠作為糖尿病模型。

1.4 實驗動物的分組方法 健康小鼠80只，適應性喂養(yǎng)1 w后，隨機抽取10只作為正常對照組(BD組)，其余按最佳工作濃度腹腔注射ALX誘導糖尿病模型，末次注射72 h后尾靜脈采血，將空腹血糖值≥11.1 mmol/L的小鼠隨機分為5組，每組10只，并分別標記為模型對照組(MoD)，苦瓜甙低劑量組(LD)，苦瓜甙中劑量組(MD)和苦瓜甙高劑量組(HD)。

1.5 實驗動物的給藥方法 給藥方法為灌胃給藥(ig)，每日1次，連續(xù)給藥21 d，觀察小鼠體征變化;灌喂當天測定小鼠體重和空腹血糖，試驗期間在每周末的同一時間測定小鼠體重，各組小鼠空腹8 h后采尾靜脈血測定血糖。見表1。

表1 實驗動物的藥劑分配

1.6 ALX糖尿病小鼠葡萄糖耐受量的測定方法 將ALX誘導糖尿病模型小鼠(MoD，LD，MD，HD)于末次給藥后禁食4 h，經(jīng)口給予葡萄糖2.5 g/kg，分別在葡萄糖灌喂后的0，30，60，120 min進行尾靜脈采血，測血糖值。觀察MoD組與LD，MD，HD組給予葡萄糖后各時間點血糖曲線下面積變化〔3〕。

1.7 檢測指標 灌喂試驗結(jié)束，禁食16 h后摘除小鼠眼球取血，將血液迅速在4℃下離心分離血清，測血糖、MDA含量、SOD活性和GSH含量。

1.8 統(tǒng)計學方法 應用SPSS11.0統(tǒng)計軟件，計量資料以s表示，組間比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 ALX誘導小鼠糖尿病模型的建立 腹腔注射到第2、3、4天時，可以有效誘導小鼠血糖升高，且穩(wěn)定性較好。但在第3及第4天時，小鼠死亡率呈上升趨勢并且較高，不適合作為藥物篩選的動物模型。到第2天為止小鼠的死亡率較低，適于藥物篩選，因此選擇第1天腹腔注射濃度為120 mg/kg的ALX，次日追加濃度為100 mg/kg的ALX用于本實驗糖尿病模型的制備。見表2，表3。

2.2 苦瓜甙對ALX糖尿小鼠體重的影響 正常對照組小鼠的體重在試驗期間穩(wěn)定增加，而在1 w內(nèi)所有糖尿小鼠的體重均有所下降，說明糖尿組小鼠出現(xiàn)高消耗臨床癥狀。經(jīng)過21 d的灌喂實驗，模型對照組小鼠的體重持續(xù)下降，并有個別死亡;苦瓜甙低、中劑量組小鼠的體重雖然仍低于初始體重，但隨著實驗的進行體重均有所回升;給藥結(jié)束時苦瓜甙高劑量組小鼠的體重與模型對照組相比增加顯著(P＜0.05)，與陽性對照組小鼠的體重接近。見圖1。

2.3 苦瓜甙對ALX糖尿小鼠空腹血糖的影響 給藥前與正常對照組相比，所有糖尿組小鼠的血糖值均顯著高于正常對照組小鼠，說明糖尿病誘導效果顯著;隨著實驗的進行，模型對照組小鼠血糖值雖然趨于平穩(wěn)，仍保持在一個較高的水平;給藥14 d后，苦瓜甙高劑量組小鼠的血糖值明顯下降，與模型對照組相比差異顯著(P＜0.05);給藥結(jié)束時苦瓜甙實驗組的血糖值均低于給藥前，與模型對照組小鼠相比差異顯著，苦瓜甙高劑量組小鼠的降糖率高達24.48%，與陽性對照組的降糖效果接近。見圖2。

2.4 苦瓜甙對ALX糖尿小鼠葡萄糖耐受量的影響 苦瓜甙、低、中高劑量下，均可明顯抑制四氧嘧啶高糖小鼠葡萄糖負荷后血糖的升高(P＜0.05)，同時可明顯減少血糖曲線下面積，對照組(34.2 ±3.1)mmol·L－1·h－1，苦瓜甙低、中、高劑量組分別為(29.5±2.8)，(25.6 ±3.5)和(21.2±3.2)mmol·L－1·h－1。見圖 3。

表2 不同濃度ALX處理后小鼠血糖濃度變化( s ，mmol/L)

表2 不同濃度ALX處理后小鼠血糖濃度變化( s ，mmol/L)

組別 第1天 第2天 第3天 第4天正常對照組5.90±0.62 5.80±0.55 6.00±0.81 5.90±0.73Ⅰ組 5.92±0.47 11.80±1.12 13.50±0.44 16.40±1.65Ⅱ組 5.93±0.80 11.40±0.99 12.00±0.87 17.00±1.97Ⅲ組 5.90±0.64 12.50±1.33 14.40±1.31 17.50±1.66Ⅳ組5.94±0.88 10.90±0.98 14.00±1.18 19.00±1.59

表3 不同濃度ALX處理小鼠后的死亡率

表4 苦瓜甙對ALX糖尿病小鼠血清MDA、SOD和GSH水平的影響(s)

表4 苦瓜甙對ALX糖尿病小鼠血清MDA、SOD和GSH水平的影響(s)

與模型組比較：1)P ＜0.01，2)P ＜0.05

組別 MDA(nmol/L)SOD(U/ml)GSH(mg/L)1.99±0.94 61.3±8.6 178.3±16.3 MoD組 3.64±0.41 44.2±9.1 112.0±16.8 LD組 2.24±1.311) 57.6±3.42) 166.9±21.41)MD組 3.25±0.89 45.8±5.6 119.0±9.92)HD組 2.89±0.592) 47.2±4.3 148.1±15.82)BD組

2.5 苦瓜甙對ALX糖尿小鼠血清抗氧化分子含量和活性的影響 見表4。糖尿病小鼠的血清MDA水平明顯增加，血清SOD水平明顯降低，均與正常對照組小鼠存在明顯差異。說明糖尿病小鼠抗氧化防御體系受到四氧嘧啶的影響，氧化應激增加，自由基產(chǎn)生率大于清除率。通過一定時間的苦瓜甙灌喂，糖尿病小鼠血清的SOD水平呈上升趨勢，且顯著高于糖尿病對照組，同時血清MDA水平明顯降低，其中苦瓜甙高劑量組MDA水平下降趨勢更明顯 (P＜0.05)。說明苦瓜甙緩解了這種氧化應激，對氧化應激損傷可能具有保護作用。值得注意的是苦瓜甙使血清GSH這種抗氧化分子活性升高，提示其可能具有抗氧化作用，避免或延緩了抗氧化分子的耗竭。

圖1 苦瓜甙對ALX糖尿病小鼠體重的影響

圖2 苦瓜甙對ALX糖尿病小鼠血糖的影響

圖3 苦瓜甙對ALX糖尿病小鼠葡萄糖耐受量的影響

3 討論

四氧嘧啶是一種特異性的胰島β-細胞毒劑，可以引起與人類相似的糖尿病模型，其原理是四氧嘧啶在體內(nèi)可選擇性被胰腺β細胞吸收，所產(chǎn)生的過量自由基能夠直接破壞β細胞的結(jié)構(gòu)，導致小鼠的胰腺損傷和壞死，降低體內(nèi)胰島素水平，使血糖明顯升高。而長期處于高血糖狀態(tài)下的小鼠由于氧化應激作用，進一步導致小鼠機體抗氧化防御體系的失衡，引發(fā)一系列糖尿病并發(fā)癥〔4，5〕。本實驗采用二次追加劑量腹腔注射四氧嘧啶的方法誘導小鼠糖尿病模型，對小鼠的血糖值變化及死亡率進行了分析。在初期造模的研究過程中，注射第3天開始小鼠死亡率明顯上升，這表明在制備糖尿病模型時四氧嘧啶的濃度過高很可能導致毒物在體內(nèi)堆積，胰腺損傷嚴重，高血糖進一步引起了機體抗氧化防御體系的失衡，最終導致死亡。故本實驗選擇第1天注射四氧嘧啶劑量為120 mg/kg，次日追加100 mg/kg，在該劑量下，注射 72 h后小鼠血糖值均高于11.1 mmol/L的標準，并且小鼠的死亡率較低，便于觀察苦瓜甙的治療效果。在試驗初期，糖尿病小鼠均出現(xiàn)了毛色發(fā)黃，精神不振;體重下降，攝食量、飲水量增加的臨床癥狀，而經(jīng)過一段時間的苦瓜甙灌喂給藥，糖尿小鼠的“三多一少”癥狀得到緩解。由于對糖尿病的發(fā)病機制尚未充分闡明，目前在糖尿病的治療過程中，控制血糖水平仍是治療的首要目標，持續(xù)性高血糖會殃及全身組織、器官及細胞，并引發(fā)慢性并發(fā)癥。本研究中苦瓜甙能夠降低四氧嘧啶誘導的糖尿病小鼠的空腹血糖值，改善受損的糖耐受量，其中苦瓜甙高劑量組的降糖效果最為顯著。提示苦瓜甙能有效控制糖尿病小鼠的血糖水平，緩解高血糖所導致的機體防御系統(tǒng)失衡，進而降低糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生率〔6，7〕。而通過一段時間的苦瓜甙灌喂治療，小鼠血清MDA水平下降，血清SOD活性和GSH含量有所提高，說明苦瓜甙降血糖的機制可能與其所具有的抗氧化作用可以減弱自由基對胰島β細胞的攻擊有關(guān)〔8〕。

1 Zachary T.Diabetic retinopathy and diabetic neuropathy〔J〕.Diabetes Care，2007;30(3)：760-5.

2 徐淑云，卞如濂，陳修.藥理實驗方法學〔M〕.第2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，1994：1269-85.

3 杜冠華.實驗藥理學〔M〕.北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學出版社，2004：372-5.

4 Robertson RP.Chronic oxidative stress as a central mechanism for glucose toxicity in pancreatic islet beta cells in diabetes〔J〕.Biol Chem，2004;279(41)：42351-4.

5 吳建中，歐仕益.番石榴多糖對糖尿病小鼠的血糖及抗氧化能力的影響〔J〕.中成藥，2007;29(5)：668-71.

6 姜宏衛(wèi)，李長貴，董硯虎.苦瓜屬植物治療糖尿病研究進展〔J〕.現(xiàn)代中西結(jié)合雜志，2002;11(2)：127.

7 朱晶英.苦瓜傷流液降血糖功效及其作用機制研究〔D〕.江蘇大學，2010.

8 毛童俊，陳偉平，高秋萍，等.蠶蛹油對糖尿病大鼠血糖及氧化應激的影響〔J〕. 營養(yǎng)學報，2010;32(3)：253-6.