顧翠英 韓志芬 夏花英 蔣嘉燁 曹紅平 金國琴 (上海中醫(yī)藥大學，上海 201203)

成纖維細胞的生物學特性改變是皮膚瘢痕是否增生的決定性因素。由此提出，是否可通過改變皮膚成纖維細胞的生物學特性以抑制瘢痕增生?金雀異黃素(Gen)是一種植物雌激素，能結合并激活哺乳類動物及人類的雌激素受體(ER)，具有類雌激素和(或)抗雌激素活性的雙重作用，故Gen既能作為雌激素又能作為抗雌激素使用。至于Gen發(fā)揮雌激素樣和(或)抗雌激素樣何種效應為主，則與使用劑量等因素有關。本課題擬在D-半乳糖(D-gal)損傷小鼠皮膚成纖維細胞(MSFs)模型基礎上，主要從ER、抗氧化及形態(tài)變化等角度，觀察Gen對MSFs的影響，為臨床治療增生性瘢痕等皮膚纖維化疾病提供實驗和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 新生24 h的 KM乳鼠，SPF級，雌雄不分，由上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。

1.2 主要藥品試劑 PRMI-1640培養(yǎng)基、0.25%Trypsin＆0.02%EDTA(吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);D-GAL、Gen和四甲基偶氮唑鹽(Sigma公司);RT試劑盒(北京百泰克生物技術有限公司);超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和乳酸脫氫酶(LDH)測試試劑盒(南京建成生物工程研究所);PCR引物合成(上海生工生物科技公司)。

1.3 主要實驗儀器 CO2培養(yǎng)箱，德國Heraeus公司。垂直式無菌無塵操作臺，造鑫企業(yè)有限公司。倒置相差顯微鏡，日本Olympus公司。PCR擴增儀，德國Biometra公司。多功能成像系統(tǒng)，上海天能科技有限公司。電泳槽和電轉儀，美國Bio-Rad公司。

1.4 方法

1.4.1 MSFs的原代培養(yǎng)和傳代 本實驗MSFs培養(yǎng)方法參照胡晉紅等〔1～4〕相關文獻，采用組織塊培養(yǎng)法進行原代培養(yǎng)，操作中個別技術作少許改良。超凈臺上無菌獲取新生24 h的KM乳鼠皮膚，精細鑷去掉皮膚下的血管等其他組織，眼科剪剪成皮膚小塊后置培養(yǎng)瓶，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待培養(yǎng)的組織塊有大量細胞游出，剔棄組織，胰酶消化，以5×104/ml密度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待原代培養(yǎng)的MSFs細胞匯合率達80% ～90%左右時，按1∶2或1∶2.5的比例進行傳代培養(yǎng)。

1.4.2 MSFs的凍存與復蘇 MSFs的凍存：凍存液為90%完全培養(yǎng)基+10%二甲基亞砜(DMSO)。取第2～4代細胞，調整細胞密度至5×105/ml后，依次進行如下操作：4℃放置30 min、－20℃放置30 min，最后置－80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

MSFs的解凍與復蘇：從-80℃冰箱取凍存管，迅速置37℃恒溫水浴箱中輕柔搖動，使其在1～2 min內完全解凍。用含20%胎牛血清的培養(yǎng)液，調整密度后接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h內全量換液。

1.4.3 實驗分組 實驗分為三組：空白對照組：用純1640培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞;D組：用10g/L D-gal藥液處理細胞;D+G組：用10 g/L D-gal+0.5 mg/L Gen藥液處理細胞。

1.4.4 SOD活性、MDA含量和LDH活性的測定 取第3～8代的MSFs，以5×104/ml的密度接種于25 cm2或75 cm2培養(yǎng)瓶。培養(yǎng)細胞3～4 d后，吸棄培養(yǎng)液，實驗組分別加入純1640培養(yǎng)液、10 g/L D-gal和 10 g/L D-gal+0.5 mg/L Gen，作用24 h，終止培養(yǎng)，取細胞上清液嚴格按試劑盒說明書操作，分別檢測SOD活性、MDA含量和LDH活性。

1.4.5 RT-PCR法檢測 MSFs的ERα mRNA和 ERβ mRNA的表達。

1.4.5.1 提取總RNA及引物設計 收集藥物作用24 h的MSFs，按Trizol試劑盒說明書提取總RNA，測定并計算A260/A280比值。參考相關文獻〔5〕設計雌激素受體 ER的引物。ERα 上游引物：5'-GACCAGATGGTCA GTGCCTT-3'，ERα 下游引物：5'-ACTCGAGAAGGTGGACCTGA-3'，擴增片段為205 bp;ERβ上游引物：5'-CAGTAACAAGGGCATGGAAC-3'，下游引物：5'-GTACATGTCCCACTTCTGAC C-3'，擴增片段為 243 bp;β-actin 上游引物：5'-AACAGTCCGCCTAGAAGCAC-3'，下游引物：5'-CGTTGACATCCGTAAAGACC-3'，擴增片段為295 bp。引物合成由上海生工生物科技公司完成。

1.4.5.2 RT-PCR反應及擴增條件 RT-PCR反應體系參照試劑盒說明，RT反應總體積為20 μl，PCR 反應體系為25 μl;擴增條件：反應條件為95℃預變性5 min，然后95℃變性30 s，65℃退火60 s，72℃延伸25 s，循環(huán)45次;72℃最后延伸5 min，4℃保存。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，上海天能科技有限公司Tanon 2500多功能成像系統(tǒng)處理。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0軟件包分析，實驗數(shù)據(jù)以s表示，多組間均數(shù)比較使用單因素方差分析。

2 結果

2.1 MSFs形態(tài) 采用組織塊貼壁法培養(yǎng)細胞時，24 h即可見較多細胞從組織的邊緣游出(見圖1)，到第3天就可見大量的細胞從組織塊遷延出，并向四周擴散生長(見圖2)。第3～8代的MSFs生長迅速，細胞融合后，排列緊密，多呈放射狀、編織狀或漩渦狀走行，有的交叉重疊生長。細胞體呈長梭形、三角形或不規(guī)則形，胞質透明，向外伸出2～3個長短不一的突起。

2.2 Gen對D-gal損傷的MSFs形態(tài)變化的影響 分別為用純1640培養(yǎng)液(空白組)、10 g/L D-gal(D組)和10 g/L D-gal+0.5 mg/L Gen(D+G組)處理24 h的細胞。由圖2可見，與空白組比較，D組的胞體明顯變細，而D+G組胞體的形狀介于空白組和D組之間，但D+G組的細胞同時存在破損現(xiàn)象，推測Gen對D-gal處理后的細胞生長形態(tài)有一定的改善作用，隨著D-gal作用時間的延長，D組的細胞皺縮，形狀變成細條形，胞體突起逐漸斷裂脫落，細胞出現(xiàn)固縮、脫落，直至離壁死亡。

圖1 MSFs形態(tài)(×40)

2.3 Gen對D-gal損傷的MSFs上清液中SOD活性、MDA含量和LDH活性的影響 由表1可見，與空白對照組相比，D組SOD活性顯著低于空白對照組(P＜0.01)。與D組相比，D+G組和空白對照組的SOD活性顯著高于D組(P＜0.01)。與空白對照組相比，D組和D+G組的MDA含量顯著高于空白對照組(P＜0.01)。與D組相比，D+G組的MDA含量顯著高于D組(P＜0.01)，說明10 g/L D-gal和10 g/L D-gal+0.5 mg/L Gen均對MSFs造成損害，而0.5 mg/L Gen則加劇了這種損害。與空白對照組相比，D組和D+G組的LDH活性顯著高于空白對照組，(P＜0.01)。與D組相比，D+G組LDH活性顯著高于 D 組(P ＜0.01)，說 明 10 g/L D-gal和 10 g/L D-gal+0.5 mg/L Gen均損傷了 MSFs膜，而0.5 mg/L Gen加劇了對MSFs細胞膜的損傷。

表1 藥物處理24 h后細胞培養(yǎng)液中SOD、LDH的活性和MDA的含量( s ，n=7)

表1 藥物處理24 h后細胞培養(yǎng)液中SOD、LDH的活性和MDA的含量( s ，n=7)

與空白對照組比較：1)P＜0.01;與D-gal組比較：2)P＜0.01

組別 SOD(U/ml)MDA(nmol/mlL)LDH(U/L)空白對照組 10.25±2.442) 0.51±0.2882) 447.09±19.802)D組 6.63±1.041) 3.75±0.3561) 774.95±11.641)D+G組 10.83±1.801) 4.16±0.5471)2) 846.45±17.421)2)

2.4 Gen對D-gal損傷的MSFs中ER mRNA表達的影響

2.4.1 各組培養(yǎng)細胞ER mRNA表達的RT-PCR產(chǎn)物電泳鑒定結果 見圖3。

2.4.2 Gen對D-gal損傷的 MSFs中 ERα mRNA和 ERβ mRNA表達影響 將RT-PCR電泳條帶經(jīng)圖像掃描儀分析，以目的基因擴增條帶/β-actin擴增條帶比值表示 ERα mRNA或ERβ mRNA相對表達水平。由表2可見：ERα和ERβ在培養(yǎng)的MSFs中均有表達，但ERα的表達明顯強于ERβ。與空白對照組相比，D組稍有下調ERα mRNA表達的趨勢，而D+G組明顯下調ERα mRNA表達(P＜0.05);與D組相比，D+G組顯著下調ERα mRNA表達(P＜0.05)。Gen對MSFs的ERβ mRNA表達影響：與空白對照組相比，D組和D+G組均明顯上調ERβ mRNA的表達;與 D組相比，D+G組則顯著上調 ER-β mRNA的表達(P＜0.05)。

圖2 Gen對D-gal損傷MSFs形態(tài)變化的影響(×400)

表2 RT-PCR檢測各組培養(yǎng)細胞ERα mRNA和ERβ mRNA的表達變化( s ，n=3)

表2 RT-PCR檢測各組培養(yǎng)細胞ERα mRNA和ERβ mRNA的表達變化( s ，n=3)

與空白對照組比較：1)P＜0.05，2)P＜0.01;與D組比較：3)P＜0.05

比值空白對照組 0.90±0.03 0.44±0.023)組別 ERα/β-actin比值 ERβ/β-actin D組 0.89±0.02 0.53±0.051)D+G組 0.71±0.071)3) 0.64±0.042)3)

圖3 ERα mRNA和ERβ mRNA的RT-PCR電泳圖

3 討論

成纖維細胞能合成和分泌膠原蛋白、彈性蛋白、生成膠原纖維、網(wǎng)狀纖維和彈性纖維等基質成分〔6〕。研究發(fā)現(xiàn)，成纖維細胞是皮膚組織受損后的主要修復細胞。正常的傷口愈合過程中，膠原的合成與降解之間維持著平衡狀態(tài)。但在病理性瘢痕中，這種正常的平衡被破壞，膠原的合成明顯超過降解，最終導致膠原的大量堆積。而膠原合成的增加可能是成纖維細胞數(shù)目增加或是膠原合成率增高的緣故。瘢痕疙瘩是病理性瘢痕的一種，其本質可能是成纖維細胞的異常增生和以膠原為主的細胞外基質過度沉積〔7〕。

雌激素作為全身調節(jié)因素之一，對成纖維細胞的增殖及其胞外基質的合成具有重要調節(jié)作用，與纖維化疾病的發(fā)生、發(fā)展關系密切，因而抑制雌激素作用有可能對纖維化疾病的治療產(chǎn)生積極的影響〔8〕。已知雌激素能通過與ER結合調控細胞的分化和增殖。ER的兩種亞型分別為ER-α和ER-β。兩種亞型在同一組織細胞上的表達水平不同，且ERβ對于ERα有抑制和調控作用〔9〕。研究表明，ERα 和 ERβ 均存在于 MSFs中〔10〕，易受到雌激素的影響。雌激素可通過ERα和ERβ直接調控成纖維細胞的增殖。Gen是一種植物雌激素，Gen的化學結構和分子質量與雌二醇相似，故能與雌二醇競爭雌激素受體，在一定的劑量范圍內產(chǎn)生抗雌激素效應。有報道提出〔11〕植物雌激素濃度＞0.5 mg/L時，其對細胞的增殖有抑制作用。余增麗等〔12〕研究報道，Gen能夠下調ERα的mRNA轉錄，但不抑制ERβ的轉錄。還有研究報道，一定濃度的雌二醇作用于離體的絕經(jīng)后婦女皮膚組織成纖維細胞后，檢測成纖維細胞ER mRNA水平，發(fā)現(xiàn)以ERβ的上調為主，提出ERβ在成纖維細胞中具有優(yōu)勢地位并存在與ERα的協(xié)同作用〔13〕。本實驗結果表明，Gen能通過下調培養(yǎng)的 MSFs的 ERαmRNA表達和上調ERβ mRNA表達，改善對D-gal處理的模型細胞的生物學性狀。本研究結果與文獻報道基本類似。

自由基衰老學說認為，細胞代謝過程中產(chǎn)生的氧自由基對于細胞成分的累積性損傷是引起細胞衰老與增殖能力喪失的重要因素，細胞內氧化與抗氧化體系的失衡是引起細胞損傷或衰老的重要原因。本實驗采用試劑盒法檢測SOD，是通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基(O－2)，后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈現(xiàn)紫紅色，用可見分光光度計(波長為550 nm)測其吸光度。當被測樣品中含有SOD活性時，則對超氧陰離子自由基有專一性的抑制作用，使形成的亞硝酸鹽減少，使測定管的吸光度值低于對照管的吸光度值，通過試劑盒說明書公式計算可求出被測樣品中的SOD活性。Gen在碳4、5、7位含有 三個酚性羥基，可作為供氫體與自由基反應，淬滅氧自由基，同時，Gen有誘導抗氧化酶SOD活性的作用〔14〕。MDA是脂質過氧化產(chǎn)物，測定MDA可間接反映自由基水平和脂質過氧化程度，其含量高低是組織細胞損傷的重要標志〔15〕。同時，MDA可以促進膠原的氧化交聯(lián)，一般老化的細胞氧化交聯(lián)較高，而年輕的細胞交聯(lián)則較低。本研究結果表明Gen的作用是以提高SOD活性占主導地位，促進模型細胞抗氧化作用，避免過多的細胞遭受D-gal的損傷作用。

本課題結果還表明，0.5 mg/L Gen處理D-gal損傷的模型細胞，可使MDA含量和LDH活性增高，通過MDA的氧化損傷作用，一定程度上有利于抑制成纖維細胞過度生長，抑制瘢痕的增生;但同時Gen也增高了SOD活性，加強了Gen對模型細胞的抗氧化損傷能力，保護模型細胞免遭過度氧化損傷。有研究報道提出〔16〕，高濃度植物雌激素也能產(chǎn)生一定的細胞毒素，這是否是導致Gen處理后，MDA含量和LDH活性增高的原因有待進一步探明。

Gen作為一種特異性酪氨酸蛋白激酶(TPK)抑制劑，能阻斷生長因子受體TPK信號轉導途徑，從而抑制細胞的過度增殖和膠原合成，對纖維化疾病(增生性瘢痕和瘢痕疙瘩)具有治療作用〔7〕。推測Gen對模型細胞的作用機制除了通過抑制酪氨酸激酶，阻斷TPK信號轉導途徑而調節(jié)細胞外基質的合成及纖維化有關外，有可能還通過ER介導的或非ER介導途徑的抗氧化作用，以抑制組織纖維化作用，抑制疤痕增生。但對ER介導的或非ER介導途徑的抗氧化作用之間聯(lián)系的詳細分子機制，及Gen對其作用的環(huán)節(jié)或靶點還需做更深入的實驗研究。

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