苗麗君 高增艷 王 靜 蔣軍廣 孫振濤 韓雪萍 張水軍

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科 河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開放實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州450052)

腦死亡供體可有效緩解器官來源缺乏和提高移植效果， 但腦死亡后供體器官損傷可能會(huì)對(duì)移植后功能產(chǎn)生不良影響，如何進(jìn)行腦死亡供體器官保護(hù)已成為研究的重點(diǎn)。核因子(NF)-κB調(diào)控著機(jī)體幾乎所有炎癥介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄，與肺損傷密切相關(guān)〔1〕。目前，有關(guān)腦死亡狀態(tài)對(duì)肺組織NF-κB表達(dá)的影響尚不完全明確。本實(shí)驗(yàn)擬觀察腦死亡狀態(tài)對(duì)肺組織形態(tài)和肺組織NF-κB mRNA及其蛋白表達(dá)的影響，以及乙酰半胱氨酸 (NAC)干預(yù)處理對(duì)肺臟形態(tài)的影響，并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理 第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的健康巴馬小型豬15只，6月齡，雌雄不限，體重(25±4)kg，術(shù)前12 h禁食，自由飲水。麻醉后行開顱術(shù)，顱內(nèi)放置Foley氣囊導(dǎo)管。隨機(jī)分為對(duì)照組、腦死亡組與NAC組，每組5只。對(duì)照組持續(xù)麻醉維持24 h，不建立腦死亡模型;24 h后撤除麻醉，動(dòng)物蘇醒后處死。參照文獻(xiàn)〔1〕建立腦死亡模型，通過呼吸、循環(huán)支持維持動(dòng)物腦死亡狀態(tài)24 h;24 h后撤除呼吸、循環(huán)支持，動(dòng)物心肺死亡。NAC組于腦死亡模型建立成功后開始經(jīng)靜脈給予NAC 150 mg/kg混合在100 ml生理鹽水中滴注1 h，隨后150 mg/kg混合在250 ml生理鹽水中滴注23 h。

1.2 標(biāo)本采集及檢測(cè)方法 腦死亡后24 h取出肺臟，切取右肺下葉組織塊。(1)常規(guī)石蠟包埋，行蘇木素-伊紅(HE)染色觀察肺臟組織變化。(2)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)肺組織NF-κB mRNA的表達(dá)：TRIzol法提取肺組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后行PCR，NF-κB及內(nèi)參照 β-actin引物根據(jù) GenBank中相應(yīng)基因序列設(shè)計(jì)，由大連寶生物工程公司合成。NF-κB引物序列：上游5'-CAT CTC CCT GGT CAC CAA GGA-3'，下游 5'-CGC ACA GCA TTC AGG TCG TAG-3'，片段長(zhǎng)度約為254 bp;β-actin引物序列：上游 5'-CAT CCT GCG TCT GGA CCT-3'，下游5'-TCA GGA GGA GCA ATG ATC TTG-3'，片段長(zhǎng)度約480 bp。產(chǎn)物置于20 g/L瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠圖像分析儀測(cè)目的基因及內(nèi)參照吸光度值并攝像，以NF-κB/β-actin的吸光度比值代表NF-κB mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。(3)S-P免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)NF-κB蛋白表達(dá)，S-P免疫組化試劑盒、顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)有限公司，NF-κB試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物公司。免疫組化結(jié)果判定：細(xì)胞染色棕黃色者為陽(yáng)性，著色定位于胞核和(或)胞質(zhì)，每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)高倍鏡視野，記數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞，陽(yáng)性率=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 肺臟組織形態(tài)學(xué)變化 光鏡結(jié)果顯示：對(duì)照組肺臟組織結(jié)構(gòu)基本正常。腦死亡組存在肺間質(zhì)彌漫性水腫，肺泡間隔增寬，肺泡腔有滲出液，局灶性肺不張，肺泡萎陷，肺毛細(xì)血管充血，肺微血管中有嗜中性粒細(xì)胞積聚附壁，肺組織中有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。NAC組有輕微病理改變，肺泡腔纖維蛋白少許滲出，肺泡間隔輕度增寬，偶見管腔內(nèi)上皮細(xì)胞脫落，罕見肺泡腔及間隔中性粒細(xì)胞滲出，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)較C組增多。見圖1。

2.2 各組NF-κB mRNA及蛋白表達(dá)水平 腦死亡組、NAC組NF-κB mRNA及蛋白表達(dá)水平均較對(duì)照組升高(P＜0.05);但NAC組升高幅度較腦死亡組低(P＜0.05)。見圖2，圖3，表1。

圖1 各組肺組織病理改變(HE染色×400)

圖2 各組肺組織NF-κB表達(dá)(×400)

表1 各組NF-κB mRNA及蛋白的表達(dá)水平( s ，n=5)

表1 各組NF-κB mRNA及蛋白的表達(dá)水平( s ，n=5)

與對(duì)照組組間比較：1)P＜0.05;與腦死亡組比較：2)P＜0.05

組別 NF-κB mRNA(吸光度比值)NF-κB蛋白(陽(yáng)性細(xì)胞率)0.648±0.171 0.091 0±0.021 3腦死亡組 2.036±0.1021) 0.718 9±0.061 61)NAC組 0.958±0.0891)2) 0.310 9±0.023 21)2)對(duì)照組

圖3 NF-κB mRNA RT-PCR產(chǎn)物電泳圖

3 討論

目前對(duì)有關(guān)腦死亡后肺臟改變的機(jī)制所知較少且不統(tǒng)一，研究發(fā)現(xiàn)，腦外傷、腦出血、腦卒中等均可并發(fā)神經(jīng)原性肺水腫、急性肺損傷等〔2，3〕。近年來，隨著腦死亡的研究進(jìn)展，炎癥介質(zhì)在外周器官損傷中的作用日益受到人們的重視〔4〕。本實(shí)驗(yàn)系列研究已經(jīng)證實(shí)，腦死亡狀態(tài)下巴馬豬血清中TNF-α、IL-1β、IL-6等細(xì)胞因子表達(dá)水平增高，提示腦死亡與炎癥介質(zhì)關(guān)系密切〔5，6〕。

NF-κB是廣泛存在于多數(shù)細(xì)胞中的一種基因轉(zhuǎn)錄因子，目前被認(rèn)為是調(diào)控機(jī)體炎癥反應(yīng)的總源頭，調(diào)控著機(jī)體幾乎所有炎癥介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄，與機(jī)體免疫應(yīng)答、缺血再灌注損傷、凋亡、炎癥等關(guān)系密切〔7〕。機(jī)體受到創(chuàng)傷、氧化、應(yīng)激等刺激后可刺激靶細(xì)胞，使NF-κB的誘導(dǎo)激酶活化，激活I(lǐng)KK，I-κB快速磷酸化降解，從而使 NF-κB 活化，發(fā)生核移位〔8，9〕，與靶基因結(jié)合，調(diào)控細(xì)胞因子、黏附分子和炎癥相關(guān)的酶及蛋白質(zhì)的表達(dá)，上調(diào)多種炎癥介質(zhì)如：TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、氧自由基等，直接參與臟器的損傷。細(xì)胞因子與NF-κB以及細(xì)胞因子間復(fù)雜的相互作用，導(dǎo)致機(jī)體炎癥反應(yīng)失控引起肺損傷。在小鼠模型的研究已經(jīng)證實(shí)NF-κB參與了許多肺部炎癥性疾病，如急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合征，并且認(rèn)為“遏制”而不是“廢除”NF-κB活化可能是一種安全有效的治療策略〔10〕。本實(shí)驗(yàn)表明，腦死亡組肺組織NF-κB mRNA及其蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高，肺組織較對(duì)照組有明顯損傷性改變：肺間質(zhì)彌漫性水腫、肺泡腔滲出、局限性肺不張、肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，提示NF-κB可能參與了腦死亡狀態(tài)下的肺損傷。

NAC是一種經(jīng)典的化痰藥物，近年來發(fā)現(xiàn)NAC還具有較強(qiáng)的抗氧化和促肺表面活性物質(zhì)生成作用。NAC是體內(nèi)游離巰基的重要組織成部分，也是谷胱甘肽(GSH)的前體物質(zhì)，可促進(jìn)GSH的合成，從而增加GSH氧化還原這一循環(huán)作用，增加自由基清除〔11〕。許多臨床證據(jù)表明，NAC對(duì)多種呼吸道疾病如慢性阻塞性肺疾病、支氣管擴(kuò)張、支氣管哮喘、肺損傷、急性呼吸窘迫綜合征、肺間質(zhì)纖維化、臟器缺血再灌注損傷等均具有很好的治療和預(yù)防作用〔12～14〕。另外 NAC是 NF-κB的抑制劑，可有效抑制NF-κB的活化，調(diào)控細(xì)胞凋亡，相應(yīng)地降低炎性細(xì)胞因子水平從而起到細(xì)胞保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)表明，應(yīng)用NAC后腦死亡狀態(tài)下肺組織損傷明顯減輕，NF-κB mRNA及其蛋白表達(dá)水平較B組也明顯下降，提示NAC對(duì)NF-κB的表達(dá)具有抑制作用，對(duì)腦死亡肺損傷具有保護(hù)作用。

腦死亡后肺組織出現(xiàn)損傷性改變，肺組織NF-κB mRNA及其蛋白表達(dá)水平增高，提示NF-κB參與了腦死亡肺損傷的過程。當(dāng)應(yīng)用NAC后，肺組織NF-κB表達(dá)降低，肺臟損傷性改變減輕，提示NAC通過抑制NF-κB的表達(dá)對(duì)肺損傷具有保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)有可能為臨床器官移植肺保護(hù)提供指導(dǎo)意義。

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