文玉軍 王登科 孫 征 劉海洋 張蓮香 王效軍 秦 毅

(寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)系，寧夏 銀川 750004)

腦出血后(TCH)，出血灶內(nèi)神經(jīng)元壞死，出血灶周圍神經(jīng)細(xì)胞大量凋亡，患者出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能障礙。減少出血灶周圍神經(jīng)元的凋亡，促進(jìn)腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)增殖并向神經(jīng)元分化對(duì)腦出血后患者的神經(jīng)功能恢復(fù)有重要意義。腦出血多發(fā)于老年人，而目前大部分的研究是以成年動(dòng)物為模型進(jìn)行的〔1〕，因此，本研究比較成年和老年大鼠腦出血后海馬齒狀回NSCs的增殖、分化，探討腦出血后NSCs的變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組與模型制備 選用健康成年(3月齡，250～300 g)和老年(18～24月齡，400～550 g)SD大鼠，由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào) SCXK(寧)20050001，分組如下：(1)檢測細(xì)胞增殖的分組：實(shí)驗(yàn)組選用制備成功的成年和老年腦出血模型大鼠各30只，每組隨機(jī)分為3、7、14、21、28 d五個(gè)亞組，每亞組 6 只;正常組成年和老年大鼠各6只;假手術(shù)組成年和老年大鼠各6只，術(shù)后7 d取材。全部按脈沖法標(biāo)記。(2)檢測細(xì)胞分化的分組：正常組和實(shí)驗(yàn)組成年和老年大鼠各6只，按累計(jì)法標(biāo)記，術(shù)后28 d取材。(3)大鼠腦出血模型的制備：參照Rosenberg等〔2〕的方法加以改良，即選用0.5 U/μlⅦ型膠原酶和 6.25 U/μl肝素的混合液0.22 μl立體定位注射到大鼠尾狀核建立腦出血模型。假手術(shù)組注入等量生理鹽水，正常組大鼠不作任何手術(shù)處理。(4)大鼠行為學(xué)評(píng)分：參照Bederson評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)〔3〕對(duì)造模后大鼠進(jìn)行評(píng)分，選取1～4分大鼠用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 BrdU標(biāo)記增殖細(xì)胞 (1)脈沖標(biāo)記：大鼠處死前24 h腹腔注射5 mg/ml的BrdU溶液，注射劑量為50 mg/kg，間隔4 h注射1次，連續(xù)注射3次，最后一次注射后24 h處死動(dòng)物。此法用于標(biāo)記NSCs的增殖變化。(2)累積標(biāo)記：大鼠腹腔注射5 mg/ml的BrdU溶液，注射劑量為50 mg/kg，每天1次，連續(xù)注射3、28 d后處死大鼠。此法能標(biāo)記較多的BrdU陽性細(xì)胞，用于檢測增殖細(xì)胞的分化情況。

1.3 細(xì)胞增殖和分化的檢測

1.3.1 BrdU免疫組化染色 經(jīng)脈沖標(biāo)記的各組大鼠按時(shí)間點(diǎn)常規(guī)心內(nèi)灌注取腦，石蠟包埋，以注射針道為中心連續(xù)冠狀切片，片厚7 μm，進(jìn)行免疫組化(SP法)檢測。切片60℃烘烤過夜，常規(guī)脫蠟至水正常山羊血清封閉(20 min，不沖洗)，加入小鼠抗大鼠BrdU抗體(1∶100，4℃過夜)，生物素標(biāo)記的二抗工作液(37℃，30 min)，HRP標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液(37℃，30 min)，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，中性樹膠封片。小鼠抗大鼠BrdU抗體購自北京中杉公司，選擇推薦的乳腺癌標(biāo)本作陽性對(duì)照、PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.3.2 BrdU/神經(jīng)元核抗原(NeuN)和BrdU/膠質(zhì)纖維酸蛋白(GFAP)雙標(biāo)染色 經(jīng)累計(jì)標(biāo)記的各組大鼠按時(shí)間點(diǎn)常規(guī)灌注取腦，石蠟包埋，以注射針道為中心連續(xù)冠狀切片，片厚7 μm，進(jìn)行免疫組化雙標(biāo)(SAP/SP法)檢測。BrdU染色除不滴加3%H2O2外，余步驟同前，用堿性磷酸酶復(fù)合物代替HRP復(fù)合物，滴加NBT/BCIP顯色30 min(深藍(lán)色)。然后分別行NeuN和GFAP染色DAB顯色。小鼠抗大鼠NeuN抗體和兔抗大鼠GFAP抗體均購自北京中杉公司，PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果觀察及數(shù)據(jù)處理 每只大鼠選3～5張切片，在400鏡下，每張切片取血腫周圍海馬齒狀回5個(gè)不重復(fù)視野區(qū)，計(jì)數(shù)BrdU陽性細(xì)胞數(shù)和BrdU/NeuN或BrdU/GFAP雙標(biāo)細(xì)胞數(shù)，利用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用s表示，進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊采用多組間兩兩比較的方差分析q檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠行為學(xué)變化和腦出血灶病理學(xué)改變 模型組大鼠在術(shù)畢清醒后即可觀察到神經(jīng)功能缺損癥狀，出現(xiàn)腦出血灶對(duì)側(cè)偏癱癥狀，表現(xiàn)為肢體活動(dòng)遲緩，進(jìn)食減少，多數(shù)大鼠易倒不能臥立，有拖步行走或旋轉(zhuǎn)爬行等神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)。術(shù)后6～24 h神經(jīng)功能障礙最為明顯，行為學(xué)評(píng)分值多為4分。腦組織HE染色顯示患側(cè)尾狀核部位神經(jīng)元大量壞死，形成出血壞死灶，周圍腦組織疏松，細(xì)胞腫脹，有炎性細(xì)胞浸潤，毛細(xì)血管管壁腫脹、破裂。

2.2 成年和老年大鼠海馬齒狀回BrdU陽性細(xì)胞數(shù)的變化及相互比較 正常組、假手術(shù)組和各出血組成年和老年大鼠的雙側(cè)海馬齒狀回均可見BrdU陽性細(xì)胞，主要分布在顆粒下區(qū)(SGZ)，細(xì)胞形態(tài)圓而規(guī)則，著色均勻。正常組、假手術(shù)組大鼠BrdU陽性細(xì)胞較少，散在分布，胞核呈圓形淡染，兩組陽性細(xì)胞數(shù)量無顯著性差異(P＞0.05)，但成年大鼠兩組BrdU陽性細(xì)胞明顯多于老年大鼠(P＜0.01)。見圖1。

成年和老年各出血組BrdU陽性細(xì)胞明顯增加，與正常組、假手術(shù)組相比有顯著性差異(P＜0.01)。出血側(cè)SGZ區(qū)的BrdU陽性細(xì)胞數(shù)在術(shù)后3 d明顯增多，7 d達(dá)到峰值，14 d后BrdU陽性細(xì)胞逐漸減少，28 d時(shí)仍高于正常組和假手術(shù)組，且成年大鼠各時(shí)間點(diǎn)BrdU陽性細(xì)胞均高于老年大鼠(P＜0.01)。出血對(duì)側(cè)SGZ區(qū)也可見BrdU陽性細(xì)胞增多，7 d時(shí)達(dá)到峰值，之后逐漸下降，與正常組、假手術(shù)組相比，各時(shí)段均有顯著性差異(P＜0.01)，且成年大鼠陽性細(xì)胞數(shù)均高于老年大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。出血對(duì)側(cè)BrdU陽性細(xì)胞增加的幅度均較相應(yīng)出血側(cè)低，兩側(cè)比較有顯著性差異(P＜0.01)。見圖2，圖 3，見表 1。

表1 成年和老年大鼠腦出血后雙側(cè)SGZ區(qū)BrdU陽性細(xì)胞數(shù)變化(個(gè)/單位面積，n=6，s)

表1 成年和老年大鼠腦出血后雙側(cè)SGZ區(qū)BrdU陽性細(xì)胞數(shù)變化(個(gè)/單位面積，n=6，s)

與老年大鼠比較：1)P＜0.01;與正常組比較：2)P＜0.01;與假手術(shù)組比較：3)P＜0.01;與出血對(duì)側(cè)比較：4)P＜0.01

組別 成年大鼠腦出血側(cè)43.97±4.29 44.57±3.20假手術(shù)組 54.17±3.481) 52.47±4.67 45.60±3.38 45.10±3.52腦出血后3 d 102.53±2.981)2)3) 61.27±3.991)2)3)4) 80.07±5.271)2) 54.70±4.051)2)3)腦出血后7 d 171.20±5.011)2)3) 104.63±5.281)2)3)4) 129.20±7.941)2) 97.77±5.211)2)3)腦出血后14 d 119.33±5.701)2)3) 75.13±3.381)2)3)4) 110.63±5.561)2) 92.00±6.111)2)3)腦出血后21 d 99.00±4.611)2)3) 64.77±2.741)2)3)4) 68.03±6.251)2) 55.60±4.871)2)3)腦出血后28 d 65.17±3.241)2)3) 59.83±3.241)2)3)4) 55.13±3.811)2) 47.87±4.381)2)4)出血對(duì)側(cè)正常組 52.30±3.491) 53.17±4.541)出血對(duì)側(cè)成年大鼠腦出血側(cè)

2.3 免疫組化雙標(biāo)結(jié)果 表2可見，和脈沖標(biāo)記相比，累積標(biāo)記的成年和老年大鼠腦內(nèi)BrdU陽性細(xì)胞明顯增多，在SGZ區(qū)、紋狀體、胼胝體均可見大量的BrdU陽性細(xì)胞，而且成年大鼠多于老年大鼠。免疫組化雙標(biāo)結(jié)果顯示，雙標(biāo)細(xì)胞主要見于SGZ周圍，正常大鼠腦內(nèi)可見少量散在雙標(biāo)細(xì)胞，腦出血后雙標(biāo)細(xì)胞數(shù)明顯增加(P＜0.01)。BrdU/NeuN雙標(biāo)細(xì)胞核大深染呈圓形，中央呈深藍(lán)色BrdU陽性，周邊呈棕色NeuN陽性(圖4)，BrdU/GFAP雙標(biāo)細(xì)胞核藍(lán)色淺染呈橢圓形，突起呈棕色長短不一(圖5)。其中老年大鼠BrdU/GFAP雙標(biāo)細(xì)胞陽性率明顯高于成年大鼠，而BrdU/NeuN雙標(biāo)細(xì)胞陽性率則明顯低于成年大鼠，兩組比較均有顯著性差異(P＜0.01)。

表2 成年和老年大鼠腦出血后SGZ區(qū)雙標(biāo)陽性細(xì)胞數(shù)變化(個(gè)/單位面積，n=6，s)

表2 成年和老年大鼠腦出血后SGZ區(qū)雙標(biāo)陽性細(xì)胞數(shù)變化(個(gè)/單位面積，n=6，s)

與正常組比較：1)P＜0.01;與成年大鼠比較：2)P＜0.01

8.63±1.52 20.20±3.08 5.77±1.10 13.37±1.33 28 d組 24.60±3.341) 23.90±2.991)15.77±2.051)2)26.27±3.421)2)BrdU/NeuN BrdU/GFAP正常組組別 成年大鼠BrdU/NeuN BrdU/GFAP 老年大鼠

圖1 正常成年和老年大鼠海馬齒狀回SGZ區(qū)BrdU陽性細(xì)胞(SP法，×400)

圖2 成年大鼠腦出血后出血側(cè)SGZ區(qū)BrdU陽性細(xì)胞(SP法，×400)

圖3 老年大鼠腦出血后出血側(cè)SGZ區(qū)BrdU陽性細(xì)胞(SP法，×400)

3 討論

在成體中樞神經(jīng)系統(tǒng)，NSCs主要存在于腦室的室管膜下層(SVZ)和海馬齒狀回SGZ〔4〕，NSCs具有星形膠質(zhì)細(xì)胞的特性，從神經(jīng)管至腦發(fā)育晚期一直存在，后形成放射狀膠質(zhì)，是新形成神經(jīng)元的父本并指導(dǎo)新神經(jīng)元的遷移〔5〕。NSCs在自然增殖過程中不斷增殖分化，并遷移到特定區(qū)域，以取代老化的神經(jīng)元，從而保護(hù)腦結(jié)構(gòu)和功能的完整性〔6〕。生理狀態(tài)下，成體腦內(nèi)SVZ和SGZ的NSCs大部分處于靜止期，在運(yùn)動(dòng)、學(xué)習(xí)、環(huán)境改變或腦缺血、缺血再灌注、腦梗死等病理性因素刺激下，其增殖分化可明顯增強(qiáng)〔7〕。腦損傷能不同程度地激活腦內(nèi)NSCs，促進(jìn)其增殖、分化并遷移至受損部位，參與損傷后神經(jīng)結(jié)構(gòu)重建和功能恢復(fù)〔8〕。

圖4 成年和老年大鼠腦出血后SGZ區(qū)BrdU/NeuN雙標(biāo)細(xì)胞(SAP/SP法，×400)

圖5 成年和老年大鼠腦出血后SGZ區(qū)BrdU/GFAP雙標(biāo)細(xì)胞(SAP/SP法，×400)

本研究結(jié)果顯示，隨著出血時(shí)間的推移，出血灶不斷機(jī)化、縮小，病理刺激減輕等因素有關(guān)。出血對(duì)側(cè)BrdU陽性細(xì)胞數(shù)較出血側(cè)少，但兩側(cè)細(xì)胞增殖的變化規(guī)律是一致的，提示雖然出血對(duì)側(cè)受到的傷害性刺激相對(duì)較弱，但腦出血后機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)，腦微環(huán)境的變化可能對(duì)雙側(cè)腦區(qū)NSCs的數(shù)量及其增殖活性均有很大影響，另外也可能與機(jī)體神經(jīng)體液調(diào)節(jié)等作用有關(guān)〔9〕。Veizovic等〔10〕將標(biāo)記的 NSCs植入成年大鼠缺血對(duì)側(cè)的腦組織，經(jīng)免疫組化染色發(fā)現(xiàn)缺血側(cè)腦組織有移植的NSCs出現(xiàn)，結(jié)合本研究，提示成年后腦內(nèi)可能還保留有早期的細(xì)胞遷移機(jī)制，并可在腦出血等腦損傷后得以活化、啟動(dòng)。

研究表明海馬與學(xué)習(xí)、記憶密切相關(guān)，在SGZ每天可產(chǎn)生大量的新生神經(jīng)元〔11〕，但隨著年齡的增長SGZ的NSCs增殖能力會(huì)不斷下降〔12〕。本研究結(jié)果提示腦老化后微環(huán)境的變化可能對(duì)相關(guān)腦區(qū)NSCs的數(shù)量或其增殖活性有影響。通過連續(xù)3 d給大鼠腹腔注射BrdU觀察成年和老年大鼠腦出血后SGZ增殖細(xì)胞的分化情況，免疫組化結(jié)果顯示，BrdU/NeuN和 BrdU/GFAP雙標(biāo)細(xì)胞主要見于SGZ周圍腦區(qū)，腦出血后雙標(biāo)細(xì)胞數(shù)明顯增加。在腦缺血、腦出血等腦損傷后，腦內(nèi)會(huì)釋放各種刺激因子，如SDF-1因子、凝血酶、促紅細(xì)胞生成素等，同時(shí)與神經(jīng)生長有關(guān)的生長因子、營養(yǎng)因子和細(xì)胞因子等也相繼釋放〔13〕，這些因素可促進(jìn)SGZ干細(xì)胞的增殖與分化，除了分化產(chǎn)生新生神經(jīng)元以補(bǔ)充神經(jīng)元的丟失外，還產(chǎn)生大量的膠質(zhì)細(xì)胞參與病灶的瘢痕修復(fù)。與成年相比，老年后腦內(nèi)微環(huán)境的變化使某些營養(yǎng)因子缺乏，有害物質(zhì)積聚，使得NSCs的增殖分化受到抑制，另外，老年后腦內(nèi)毛細(xì)血管明顯減少，其超微結(jié)構(gòu)及血管形狀發(fā)生明顯變化，腦血流量也顯著下降，這些變化不僅可導(dǎo)致原有神經(jīng)元的退行性變，還直接影響新生神經(jīng)元的增殖和存活〔14〕。

1 Li Y，Chopp M.Temporal profile of nestin expression after focal cerebral ischemia in adult rat〔J〕.Brain Res，1999;838(1-2)：1-10.

2 Rosenberg GA，Mun-Bryce S，Wesley M，et al.Collagenase-induced intracerebral hemorrhage in rats〔J〕.Stroke，1990;21(5)：801-7.

3 Bederson JB，Pitts LH，Tsuji M，et al.Rat middle cerebral artery occlusion：evaluation of the model and development of a neurologic examination〔J〕.Stroke，1986;17(5)：472-6.

4 Doetsch F，Caille I，Lim DA，et al.Subventricular zone astrocytes are neural stem cells in the adult mammalian brain〔J〕.Cell，1999;97(6)：703-16.

5 袁瓊蘭，劉小青.干細(xì)胞治療缺血性腦損傷的研究進(jìn)展〔J〕.解剖學(xué)雜志，2011;34(3)：281-4.

6 Kuhu HG，Dickinson-Anson H，Gage FH.Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat：age-related decrease of neuronal progenitor proliferation〔J〕.Neurosci，1996;16(6)：2027-33.

7 Prickaerts J，Koopmans G，Blokland A，et al.Learning and adult neurogenesis：survival with or without proliferation〔J〕?Neurobiol Learn Mem，2004;81(1)：1-11.

8 劉遠(yuǎn)新，苗常青.腦梗死與內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的研究進(jìn)展〔J〕.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007;28(8)：963-5.

9 Udo H，Yoshida Y，Kino T，et al.Enhanced adult neurogenesis and angiogenesis and altered affective behaviors in mice overexpressing vascular endothelial growth factor〔J〕.J Neurosci，2008;28(53)：14522-36.

10 Veizovic T，Beech JS，Stroemer RP，et al.Resolution of stroke deficits following contralateral grafts of conditionally immortal neuroepithelial stem cells〔J〕.Stroke，2001;32(4)：1012-9.

11 Gage FH.Mammalian neural stem cells〔J〕.Science，2000;287(5457)：1433-8.

12 汪建民，袁群芳，姚志彬.大鼠室管膜下區(qū)和齒狀回神經(jīng)前體細(xì)胞增殖的衰老性變化〔J〕.神經(jīng)解剖學(xué)雜志，2002;18(1)：17-20.

13 Hua Y，Keep RF，Hoff JT，et al.Brain injury after intracerebral hemorrhage：the role of thrombin and iron〔J〕.Stroke：2007;38(1)：759-62.

14 Raddle DR，Sonntag WE，Lichtenwalner RJ.Microvascular plasticity in aging〔J〕.Aging Res Rev，2003;2(2)：149-68.