黃 偉 侯建明 李麗緯 甄艷軍 李志永 (河北醫(yī)科大學西校區(qū)基礎課教學部，河北 石家莊 05009)

我們以往的整體動物實驗表明偏硅酸鈉能抑制高脂血癥條件下動脈粥樣硬化(AS)的形成和發(fā)展，近期我們通過細胞培養(yǎng)證實偏硅酸鈉可以下調氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)刺激的某些炎性因子的基因表達，減少炎性因子釋放，抑制細胞黏附，提示抑制炎性反應是偏硅酸鈉的抗AS作用機制之一〔1〕。一氧化氮(NO)代謝異常，誘導型一氧化氮合酶(iNOS)表達增加是細胞炎性反應的又一重要標志，本文以具有內皮細胞特點的膀胱癌細胞株ECV-304為材料，觀察偏硅酸鈉對ox-LDL刺激的iNOS表達的抑制作用，并探討其可能的機制，以進一步豐富偏硅酸鈉抗炎、抗AS作用的基礎研究。

1 材料與方法

1.1 材料 ECV304細胞株(武漢大學中國動植物細胞保藏中心，此為膀胱癌細胞株，但是具有許多內皮細胞特性)，新生小牛血清(四季青公司)，DMEM培養(yǎng)液和胰酶(GIBCO公司)，NO、NOS、iNOS試劑盒(南京建成生物工程研究所)，TRIzol試劑和PCR試劑盒(北京天根公司)，兔抗人β-Actin抗體、兔抗人iNOS抗體、辣根酶標記羊抗兔IgG(北京博奧森生物技術有限公司)，ECL(美國Santa Cruz公司)，其他試劑均為國產分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 ox-LDL的制備 參照文獻〔2〕制備。

1.2.2 細胞培養(yǎng)與分組 含15%新生小牛血清的DMEM作為ECV304細胞株培養(yǎng)液，5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)，對數生長期細胞的培養(yǎng)液換成無血清DMEM培養(yǎng)液，6 h后分成5組。①正常對照組：無血清 DMEM培養(yǎng)液;②oxLDL組：無血清DMEM培養(yǎng)液中加入終濃度為 80 μg/ml的 ox-LDL;③68.5 mg/L組：無血清DMEM培養(yǎng)液中加入Na2SiO3使硅終濃度為68.5 mg/L。④34.2 mg/L組：硅終濃度為34.2 mg/L。⑤17.1 mg/L組：硅終濃度為17.1 mg/L。③④⑤組均在培養(yǎng)1 h后加入終濃度80 mg/L的ox-LDL。12 h后收集細胞和培養(yǎng)液，檢測有關指標。

1.2.3 培養(yǎng)液中NO含量檢測 各組細胞培養(yǎng)液收齊后，按照試劑盒說明步驟，硝酸還原酶法測NO含量。

1.2.4 細胞內NOS、iNOS活性檢測 各組細胞收齊后，反復凍融細胞，使細胞破裂，按照試劑盒說明步驟，化學比色法測NOS和iNOS活性，用比活性表示。蛋白含量采用考馬斯亮藍法測定。

1.2.5 細胞iNOS mRNA、LOX-1 mRNA、NOX4 mRNA的檢測采用半定量反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)方法測定。按Trizol試劑盒說明書提取各組細胞總mRNA，RNA的反轉錄及擴增過程按試劑盒說明書進行。擴增時的引物和條件為iNOS上游引物：AGCGGTAACAAAGCAGATAGA，下游引物：CACAAGGTCAGGTGGGATT(擴增長度361 bp)，5 min預變性后，94℃ 70 s、56℃ 45 s、72℃ 70 s循環(huán)30次。LOX-1上游引物：TGGGAAAAGAGCCAAGAGAA，下游引物：TGCAGCCAGCTAAATGACAG(229 bp)，5 min 預變性后，94℃ 45 s、51.8℃ 40 s、72℃ 50 s循環(huán)30次。NOX4上游引物：CTCAGCGGAATCAATCAGCTGTG，下 游 引 物：AGAGGAACACGACAATCAGCCTTA(286 bp)，5 min 預變性后，94℃ 60 s、58℃ 60 s、72℃ 60 s循環(huán)30次。GAPDH上游引物：GTGAAGGTCGGAGTCAACG，下游引物：GGTGAAGACGCCAGTGGACTC(300 bp)，5 min預變性后，94℃ 30 s、57℃ 30 s、72℃ 40 s循環(huán)30次。30 個循環(huán)后72℃延伸5 min。取10 μl反應產物在1%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，電泳圖像分析系統(tǒng)進行檢測，以各基因與GAPDH的灰度值比值代表mRNA的表達水平。

1.2.6 iNOS蛋白表達的檢測 采用Western印跡檢測細胞內iNOS蛋白量。按TRIzol試劑盒說明書提取細胞蛋白，步驟簡述如下：TRIzol處理細胞得到勻漿，離心，分離出含蛋白的有機相，用異丙醇沉淀蛋白，分別用含0.3 mol/L鹽酸胍的95%的乙醇和無水乙醇洗滌蛋白，真空干燥，1%的SDS溶解蛋白質。所得蛋白經SDS-PAGE電泳、轉膜后分別與一抗(兔抗人iNOS)、二抗(羊抗兔IgG，稀釋度1∶3 000)室溫孵育1 h，洗膜，ECL發(fā)光法檢測蛋白含量。以β-actin作為內參照，掃描灰度，計算iNOS與β-actin的比值。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS10.0軟件進行方差分析。

2 結果

2.1 培養(yǎng)液中NO含量變化 ox-LDL組培養(yǎng)液NO濃度較對照組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，只有正常水平的31.9%。加偏硅酸鈉的三個組均使NO濃度顯著上升(P＜0.01)，其中68.5 mg/L組和34.2 mg/L組的NO濃度恢復到接近正常水平，見表1。

2.2 細胞NOS、iNOS活性、iNOS mRNA、iNOS蛋白表達的變化 表1和圖1顯示ox-LDL組NOS活性較正常對照組明顯降低，iNOS活性則明顯升高。加偏硅酸鈉后各組NOS活性比ox-LDL組升高，iNOS活性則下降(P＜0.01)。68.5 mg/L組iNOS活性比 ox-LDL組降低 55.6%，34.2 mg/L組降低 44.4%，17.1 mg/L組降低47.2%。細胞內iNOS蛋白量和mRNA水平的變化呈現與iNOS活性相同的趨勢。34.2 mg/L組的iNOS蛋白和mRNA分別比ox-LDL組降低66.5%和37.6%(P＜0.01)。

2.3 細胞LOX-1 mRNA和NOX4 mRNA的變化 ox-LDL組細胞的LOX-1 mRNA和NOX4 mRNA水平顯著增高，培養(yǎng)液中加入硅含量32.2 mg/L的偏硅酸鈉后細胞LOX-1 mRNA和NOX4 mRNA均明顯被下調(P＜0.01)，見圖2，表2。

表1 Na2SiO3對ECV304細胞NO、NOS和iNOS的影響(n=5，s)

表1 Na2SiO3對ECV304細胞NO、NOS和iNOS的影響(n=5，s)

與對照組比較：1)P＜0.01;與ox-LDL組比較：2)P＜0.01

組別NO(μmol/L)NOS活性(U/mg蛋白)iNOS活性(U/mg蛋白)iNOS蛋白(iNOS/β-actin)iNOSmRNA(iNOS/GADPH)±0.014 0 0.202±0.006 ox-LDL組 56.69±19.151) 0.140±0.0291) 0.108±0.0401) 0.908±0.027 41) 0.771±0.0161)68.5 mg/L組 179.86±4.432) 0.186±0.0412) 0.048±0.0082) － －34.2 mg/L組 164.98±16.552) 0.299±0.0382) 0.060±0.0052) 0.304±0.009 02) 0.481±0.0172)17.1 mg/L組 80.82±13.552) 0.175±0.0212) 0.057±0.0032)對照組 177.74±15.59 0.637±0.046 0.037±0.007 0.106－－

表2 細胞LOX-1 mRNA和NOX4 mRNA的變化

圖1 iNOS蛋白和mRNA的表達

圖2 偏硅酸鈉對ox-LDL刺激的NOX和LOX-1 mRNA的調節(jié)作用

3 討論

ECV304細胞株很長時間被視為人臍靜脈內皮細胞株而用于有關AS的研究，2000年后進一步鑒定發(fā)現ECV304兼具膀胱癌細胞株T24和內皮細胞的特性〔3〕。本文以ox-LDL刺激ECV304細胞，觀察偏硅酸鈉抑制炎性反應的情況，其結果對其他細胞特別是內皮細胞有參考價值。

ox-LDL既能抑制內皮細胞的內皮型一氧化氮合酶(eNOS)活性也能抑制eNOS基因表達，同時刺激iNOS表達。酶活性的異常變化引起NO代謝異常，進而引發(fā)AS等炎癥性疾病〔4，5〕。抑制前炎因子對iNOS表達的刺激作用、糾正NO代謝異常是抗炎、抗AS的重要環(huán)節(jié)〔6〕。我們曾證實偏硅酸鈉能抑制ECV304細胞黏附單個核細胞，提示偏硅酸鈉的抗炎作用〔1〕。本實驗提示ox-LDL使ECV304細胞eNOS活性降低(總NOS活性減去iNOS活性基本代表eNOS的活性)。iNOS的mRNA和蛋白量均升高，表明ox-LDL通過上調iNOS基因表達而使ECV304細胞內iNOS活性增加。上述結果與文獻報道的ox-LDL對內皮細胞的影響相吻合。培養(yǎng)液加入偏硅酸鈉后，高、中、低三個濃度組均顯示很大程度抑制了ox-LDL對NOS和iNOS的影響，這個結果為偏硅酸鈉抗炎、抗AS作用提供了新的實驗依據。

ox-LDL刺激內皮細胞炎性反應的機制之一是通過LOX-1激活NADPH氧化酶(NOX)。NOX有多個類型，其中NOX4主要分布在內皮細胞。正常情況下NOX4活性處于低水平狀態(tài)，ox-LDL經由LOX-1介導刺激NOX4表達，NOX4催化產生大量活性氧(ROS)，增多的ROS可通過激活NF-κB、AP-1等轉錄因子活性引起一系列炎癥反應相關基因表達，其中包括iNOS基因〔7～9〕。本實驗觀察到 oxLDL組的 LOX-1和 NOX4 mRNA水平顯著增加，這可能就是ECV304細胞iNOS基因表達增加的上游事件。用偏硅酸鈉干預后，細胞內LOX-1和NOX4 mRNA水平大幅下降，提示偏硅酸鈉下調iNOS mRNA表達的機制之一就在于其首先抑制ox-LDL刺激的LOX-1和NOX4表達，進而減少細胞內ROS的生成。偏硅酸鈉通過何種方式抑制ox-LDL的刺激作用值得進一步探索。

1 黃 偉，李麗瑋，甄艷軍，等.偏硅酸鈉對ECV-304細胞株與單個核細胞黏附的影響〔J〕.中國老年學雜志，2009;29(4)：796-8.

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5 Lowenstein CT，Padalko Elizaveta.iNOS(NOS2)at a glance〔J〕.J Cell Sci，2004;117(14)：2865-7.

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