劉紅艷 葉 松 冉昌麗 王海燕 郭靜明

(宜昌市中心人民醫(yī)院血液科 三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，湖北 宜昌 443003)

非霍奇金淋巴瘤(NHL)按目前常規(guī)的治療方案(如CHOP方案)，約有30% ～40%的病例可長期緩解，但是仍有約60%～70%的患者常規(guī)治療失敗和復(fù)發(fā)，挽救性治療的效果較差。因此迫切需要發(fā)現(xiàn)更有效的治療手段和措施。白介素-21(IL-21)是一類新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，與Th1密切相關(guān)，發(fā)揮防御腫瘤的作用〔1〕，與其他抗腫瘤制劑聯(lián)用還可減少制劑用量，延長患者存活期〔2〕。IL-21還能通過提高細(xì)胞毒 T淋巴細(xì)胞(CTL)、T淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)其殺傷腫瘤的細(xì)胞毒作用，同時(shí)促進(jìn)干擾素(IFN)-γ、腫瘤壞死因子(TNF)-α的分泌，增強(qiáng)殺傷細(xì)胞的敏感性，從而發(fā)揮其免疫增強(qiáng)的作用。本課題通過實(shí)驗(yàn)，說明IL-21能促進(jìn)CTL增殖而殺傷NHL細(xì)胞的作用，為臨床治療提供潛在的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料 人非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞株(Raji)購自同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院血液病研究所，單個(gè)核細(xì)胞來自健康人外周血。

1.2 主要試劑 RPMI1640，IMDM，F(xiàn)BS購自 Gibco公司，F(xiàn)i-coll購自武漢御和生物公司，抗CD2磁珠購自Miltenyi公司。TNF-α、IL-21購自Pepro Tech公司。ELISA試劑盒購自Bender公司。TRIZOL為Invitrogen公司產(chǎn)品，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq DNA和dNTP為Fermentas公司產(chǎn)品，PCR引物由上海生物工程公司合成，DNA Marker購自深圳晶美公司，EDTA及EB為Sigma公司產(chǎn)品，瓊脂糖購自Biowest公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)樹突細(xì)胞(DCs)抽取健康人外周血10 ml，肝素抗凝(20 U肝素/1 ml全血)。將全血用RPMI-1640對(duì)倍稀釋，充分混勻。向干凈的離心管中加入0.077 g/ml Ficoll-Hypaque細(xì)胞分離液10 ml，離心15 min。用吸管取中間的淡黃色單個(gè)核細(xì)胞層。用Hank's液洗滌2次，棄上清液，用RPMI-1640洗滌1次，離心。調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/ml，加入磁珠標(biāo)記的抗CD2單抗于10℃，將細(xì)胞混液加入到Mini MACS細(xì)胞分離柱中，以IMDM培養(yǎng)基，此即為CD2+的DC細(xì)胞。

1.3.2 誘導(dǎo)腫瘤特異性CTL 以含10%FBS、1% 抗生素、GM-CSF(1 000 U/ml)、IL-4(500 U/ml)、TNF-α(1 000 U/ml)的RPMI-1640懸浮細(xì)胞，同時(shí)加入淋巴瘤細(xì)胞凍融抗原50 μl，接種于60 cm2的培養(yǎng)皿中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)分組 將此培養(yǎng)液分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組于第7天后加入100 ng/ml的IL-21。14 h后以ELISA法、RTPCR檢測IFN-γ和TNF-α濃度，皆按照試劑盒說明進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS11.0醫(yī)用統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用s表示，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果

2.1 IL-21影響CTL上清中的細(xì)胞因子IFN-γ 和TNF-α 經(jīng)IL-21(100 ng/ml)誘導(dǎo)，CTL細(xì)胞14 h上清中IFN-γ的含量為(469.32 ± 2.83)pg/ml，TNF-α 為(82.52 ± 4.72)pg/ml;對(duì)照組上清中IFN-γ 的含量為(27.63 ± 2.76)pg/ml，TNF-α 為(11.63±1.54)pg/ml，兩組相比差異顯著(P＜0.05)。

2.2 IL-21影響CTL中 IFN-γ 和 TNF-α 的 mRNA表達(dá) CTL細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)14 h后，分別提取有無IL-21誘導(dǎo)的各組mRNA，測定IFN-γ 和 TNF-α 的 mRNA 表達(dá)量(圖 1)。IFN-γ 和 TNF-α的mRNA表達(dá)量，均隨著培養(yǎng)的時(shí)間延長而減少，見表1。

圖1 IL-21對(duì)CTL中IFN-γ和TNF-α mRNA表達(dá)的影響

表1 IL-12對(duì)CTL中IFN-γ mRNA表達(dá)的影響(s)

表1 IL-12對(duì)CTL中IFN-γ mRNA表達(dá)的影響(s)

與對(duì)照組比較：1)P＜0.05

組別 IFN-γ TNF-α對(duì)照組40 000±1 100 6 000±154實(shí)驗(yàn)組 4 800±2471) 213±1021)

3 討論

機(jī)體的免疫系統(tǒng)能夠識(shí)別和清除腫瘤細(xì)胞，因此利用自身T淋巴細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞免疫治療已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。DCs不僅可以有效攝取和提呈腫瘤抗原，而且通過提供活化T細(xì)胞所必需的共刺激信號(hào)，使T細(xì)胞被充分激活和有效增殖。因此，利用DCs提呈腫瘤抗原進(jìn)而誘導(dǎo)特異性CTL是腫瘤免疫治療的一個(gè)熱點(diǎn)。

IL-21主要是由活化后的CD4+T細(xì)胞分泌。RT-PCR研究結(jié)果顯示在機(jī)體正常情況下IL-21的表達(dá)量很少，但在模擬T細(xì)胞活化的條件下可誘導(dǎo)IL-21的高水平表達(dá)，IL-21主要起著廣泛的免疫調(diào)節(jié)功能。眾多的研究表明，IL-21可以增強(qiáng)腫瘤免疫治療的效果。在用DCs細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗自體黑色素瘤CTL中，IL-21可以成10倍增加CTL的增殖及活性〔3〕。IL-21可提高CTL的增殖和增強(qiáng)其殺傷腫瘤的細(xì)胞毒作用〔4〕，并促其分泌IFN-γ，IFN-γ可上調(diào)腫瘤細(xì)胞表面MHC-I類分子的表達(dá)，增強(qiáng)對(duì)殺傷細(xì)胞的敏感性〔5，6〕。在本次研究中，有IL-21實(shí)驗(yàn)組，DC誘導(dǎo)的CTL產(chǎn)生IFN-γ和TNF-α明顯增加，此兩種細(xì)胞因子分泌的增加大大提高了CTL對(duì)Raji細(xì)胞的殺傷作用。證實(shí)IL-21促進(jìn)CTL對(duì)Raji細(xì)胞殺傷可能部分是通過促使CTL高表達(dá)IFN-γ和TNF-α而實(shí)現(xiàn)。

1 姚金晶，陳宜濤.Th1/Th2平衡調(diào)節(jié)與疾病發(fā)生的研究進(jìn)展〔J〕.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009;9(13)：2597-600.

2 Skak K，Kragh M，Hausman D，et al.Interleukin 21：combination strategies for cancer therapy〔J〕.Nat Rev Drug Discov，2008;7(3)：231.

3 趙明峰.白細(xì)胞介素21——一種新的免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)因子〔J〕.國際免疫學(xué)雜志，2008;31(3)：360-4.

4 van derVliet HJ，Koon HB，Yue SC，et al.Effects of the administration of high-dose interleukin-2 on immunoregulatory cell subsets in patients with advanced melanoma and renal cell cancer〔J〕.Clin Cancer Res，2007;13(1)：2101-8.

5 Skak K，Kragh M，Hausman D，et al.Interleukin 21：combination strategies for cancer therapy〔J〕.Nat Rev Drug Discov，2008;7(2)：231-40.

6 Sondergaard H，F(xiàn)rederiksen KS，Thygesen P，et al.Interleukin 21 therapy increases the density of tumor infiltrating CD8+T cells and inhibits the growth of syngeneic tumors〔J〕.Cancer Immunol Immunother，2007;56(9)：1417-28.