向 薇 (湖北民族學院附屬民大醫(yī)院急救中心，湖北 恩施 445000)

血清中腫瘤標志物的檢測為惡性腫瘤在危險人群中的篩查提供了一種簡便可靠的手段，但是由于其含量往往很低，導致必須用相對靈敏的方法才可以檢測到，并且有漏診的可能。此前，在臨床上應(yīng)用較多的腫瘤標志物主要為糖蛋白抗原(CA125)，CA15-3 和鱗狀細胞癌抗原(SCCA)〔1～3〕。由于這 3種靶分子在卵巢癌，子宮內(nèi)膜癌和宮頸癌患者中有一定的偏嗜性分布，因此即使聯(lián)合測定也存在著漏診的可能。本文針對婦科盆腔惡性腫瘤以上皮性腫瘤為主的特點，建立了檢測外周血細胞角蛋白20(ck20)mRNA的RT-PCR測定方法，并與其他三種腫瘤標志物聯(lián)合對臨床患者進行了實驗性檢測。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇因盆腔腫瘤入院，行腫瘤摘除術(shù)的患者。依據(jù)術(shù)后病理診斷進行分組，其中子宮內(nèi)膜癌17例，年齡47～61〔平均(52.5±5.2)〕歲;卵巢癌 11例，年齡 44～65〔平均(50.3±5.7)〕歲;宮頸癌 14例，年齡 43～58〔平均(49.7±6.2)〕歲;子宮肌瘤18例，年齡39～55〔平均(47.2±6.8)〕歲。收集手術(shù)患者術(shù)前及術(shù)后第30天外周靜脈血，部分以乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝用于外周血單個核細胞(PBMC)RNA的提取;部分不抗凝，用于血清腫瘤標志物的ELISA檢測。同時收集術(shù)中切除的腫瘤組織，作為ck20基因表達的陽性對照。對照人群：參加體檢的健康婦女，無免疫病史及腫瘤家族史，年齡38～59〔平均(51.4±7.8)〕歲。采集外周血，同樣分為EDTA抗凝及未抗凝部分。RNA提取試劑Trizol，superscriptⅡ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，Taq DNA聚合酶為Invitrogen(Lifescience，USA)公司產(chǎn)品。DNA分子量標志為Takara(Japan)公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 PBMC總RNA的提取 取2 ml抗凝血與等體積磷酸鹽緩沖液(PBS)充分混合，緩慢滴加于0.2 ml PBMC分離液中(6.4% Ficoll，9.9% sodium diatrizoate，0.07% NaCl)，2 000 r/min，水平離心20 min。以毛細吸管吸取中間層的PBMC至另一離心管中，加入3倍體積的PBS，1 500 r/min，離心10 min;重復洗滌細胞3次。加入1 ml TRizol試劑，按照說明書進行提取總RNA。同時，取1 g術(shù)中切除的子宮內(nèi)膜組織提取組織總RNA。測定每個樣本的A260/A280，判定所提取總RNA的純度及濃度。

1.2.2 ck20 mRNA表達的RT-PCR檢測 (1)引物設(shè)計：根究GenBank(NM_019010)發(fā)布的人ck20基因序列設(shè)計巢式引物：外部基因正向 (P1)：5'-GCGTTTATGGGGGTGCTGGAG-3'，反向(P2)：5'-GGCTCTGGGAGGTGCGTCTC-3';內(nèi)部基因正向：(P3)：5'-CGGGGGGGACCTGTTTGT-3'，反向 (P4)：5'-CAGTGTTGCCCAGATGCTTGTG-3'。同時擴增 β-肌動蛋白(β-actin)基因為內(nèi)參，正向 5'-ATCATGTTTGAGACCA-3';反向：5'-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3'。(2)PCR：以 1 μl cDNA 為模板，P1、P2為引物進行首次擴增，94℃預變性5 min，94℃30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40 次循環(huán)，72 ℃最終延伸5 min。取首次擴增產(chǎn)物0.5 μl，P3、P4為引物進行二次擴增，退火溫度變?yōu)?2℃，其余條件同上。1.2%瓊脂糖凝膠電泳，溴乙錠(EB)染色對二次擴增產(chǎn)物進行鑒定，預期大小為485 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA序列分析證實為人ck20基因。β-actin基因PCR過程，94 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min、55 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min，循環(huán)30次，72℃再延伸5 min。1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴增產(chǎn)物，預期大小為318 bp。

1.2.3 三種血清腫瘤標志物的ELISA測定 以所購買的血清CA125，CA15-3及SCCA ELISA試劑盒檢測血清中三種腫瘤標志物的含量，按試劑盒說明書完成。采用國際通用標準判斷結(jié)果是否為陽性，其中 CA125＞35 kU/L，CA15-3＞28 kU/L，SCCA＞1.5 mg/L確定為陽性。

1.3 統(tǒng)計學分析 計量資料采用t檢驗，計數(shù)資料采用 χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR擴增ck20 mRNA 所有樣本均可有效擴增出β-actin基因。自子宮內(nèi)膜組織及患者的外周血樣本中可擴增出ck20基因，其片段大小與預期相符并經(jīng)DNA序列分析確證，健康對照血樣中未擴增出ck20基因。見圖1。

2.2 ck20 mRNA在不同組別、不同階段的分布 外周血樣本中ck20 mRNA的檢出率在良、惡性腫瘤間存在著明顯的差異。子宮肌瘤及健康對照人群的血樣中均無檢出。而在三種惡性盆腔腫瘤組的術(shù)前血樣中均有較高的陽性率〔子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、宮頸癌分別為 13例(76.4%)、7例(63.6%)、6例(42.9%)〕，且在不同類型的腫瘤中檢出率差別較大(P＜0.05)。另外，惡性腫瘤組術(shù)后血樣的檢出率〔子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、宮頸癌分別為2例(11.8%)、3例(27.3%)、0例〕均較術(shù)前顯著下降(P＜0.05)。

2.3 健康人群中三種血清腫瘤標志物的濃度 健康人群中CA125、CA15-3、SCCA 水平分別為(14.8 ±1.9)kU/L、(12.5 ±1.4)kU/L、(0.7±0.09)mg/L，均明顯低于本文的陽性值。

2.4 四種腫瘤標志物在血液樣本中的陽性分布 包括ck20 mRNA在內(nèi)的四種腫瘤標志物在三種盆腔惡性腫瘤中均有較高的陽性檢出率，且表現(xiàn)出一定的特征性分布。其中ck20在子宮內(nèi)膜癌的陽性率遠高于其他腫瘤，CA125在卵巢癌中的陽性率最高，SCCA陽性樣本則以宮頸癌為主。18例良性腫瘤僅有1例表現(xiàn)出CA15-3的弱陽性(29.1 kU/L)，健康對照人群中無1例陽性結(jié)果，證明這4種腫瘤標志物對于惡性腫瘤的檢測是特異的。見表1。

2.5 腫瘤標志物聯(lián)合測定的價值 四種標志物聯(lián)合測定，其陽性結(jié)果可以涵蓋所有病例，大大降低漏診率。見表2。

圖1 PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳

表1 各類患者血清CA125，CA15-3，SCCA及外周血ck20基因檢測陽性率〔n(%)〕

表2 四項指標在手術(shù)病人中的綜合分布〔n(%)〕

3 討論

通過檢測外周血中ck20 mRNA判定是否有侵襲入血的上皮細胞，已被用于包括肺癌、膀胱癌、結(jié)直腸癌等多種上皮性惡性腫瘤的診斷及預后評價〔4～6〕。最新的研究還表明，ck20基因在病灶部位的表達強弱還與宮頸癌的惡性程度相關(guān)〔7〕。為此，本文嘗試將ck20 mRNA作為上皮性惡性腫瘤的外周血腫瘤標志物，與其他三種常用的婦科惡性腫瘤標志物相聯(lián)合，用于臨床患者的測定。結(jié)果證實了此檢測方法的可行性;表明外周血ck20可以有效地作為惡性上皮性腫瘤的存在及評價預后的指標;臨床上只有同時進行多種腫瘤標志物的聯(lián)合測定才能夠保證無漏診之虞。

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