張競之 陳小憶 金偉孝 李華鋒 區(qū)鴻斌 (廣州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院中醫(yī)科，廣東 廣州 510620)

高血壓(EH)是一種與多因素有關(guān)的疾病，其發(fā)病機制尚未完全明確。研究表明，血管內(nèi)皮損傷在原發(fā)性高血壓的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，EH患者的內(nèi)皮功能均存在不同程度的損傷〔1〕。本研究從Toll樣受體信號途徑(TLR-NF-κB)入手，通過觀察丹皮酚對EH患者血清損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞Toll樣受體(TLR4)、核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)表達的影響，從炎癥免疫的角度面探討其保護EH血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的機制。

1 材料與方法

1.1 病例選擇與分組 所選患者均為2007年3月至2008年6月在暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院符合世界衛(wèi)生組織/國際高血壓學(xué)會統(tǒng)一診斷標(biāo)準(zhǔn)的2、3級EH確診者。其中，EH組40例，男23例，女17例，年齡50～70歲，平均(65.23±8.46)歲，平均收縮壓(168.63±14.45)mmHg，平均舒張壓(105.93±8.27)mmHg，入選患者均排除糖尿病、心、腦、腎等靶器官損害及并發(fā)癥，檢查前1 w未服用影響血壓的藥物。健康組30例，為暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院中醫(yī)系研究生健康志愿者，血壓均在正常范圍，與EH患者血壓比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

1.2 血清收集 患者組及健康對照組均空腹抽血，采血前患者均未使用任何藥物，無菌采集前臂靜脈血，置入無菌帶帽不抗凝干燥試管，自凝后4℃，2 000 r/min離心15 min，取上清液置無菌EP管，恒溫水浴箱56℃滅活30 min，－20℃凍存，備用。

1.3 細(xì)胞與主要試劑 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株HUVEC-C購自武漢“中國典型培養(yǎng)物保藏中心”。DMEM培養(yǎng)基、南美胎牛血清購自Gibco公司。TaKaRa SYBRR ExScript TM RT-PCR Kit(Perfect Real Time)試劑盒購自大連寶生物工程有限公司。Trizol試劑購自Invitrogen公司。熒光定量PCR特異性引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。蛋白Marker購自Invitrogen公司。H-TLR-4一抗購自Santa公司。H-NF-κBa一抗購自 CST公司。二抗購自Cell Signal公司。ECL發(fā)光試劑盒購自Cell Signal公司。PVDF膜購自Axygen公司。丹皮酚購自中國藥品生物制品檢定所，批號：110708-200505。脂多糖(LPS)系北京普博欣生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)與條件培養(yǎng)基配制 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株HUVEC-C培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，隔天換液，0.25%胰酶消化傳代。丹皮酚母液的配制：20 mg丹皮酚溶于2 ml DMEM中，使其溶濃度為10 g/L，4℃避光保存。LPS母液的配制：1 mg LPS溶于1 ml DMEM中，使其溶濃度為1 g/L，4℃避光保存。條件培養(yǎng)基按實驗設(shè)計如下配制：EH組：10%EH患者血清 +90%DMEM;健康組：10%健康人血清 +90%DMEM;LPS 誘導(dǎo)組：8 990 μl DMEM+1 000 μl健康人血清 +10 μl LPS 母液;丹 皮 酚小 劑量 (100 μg/ml)組：8 890 μl DMEM+1 000 μl健康人血清 +100 μl丹皮酚母液 +10 μl LPS母液;丹皮酚中劑量(200 μg/ml)組：8 790 μl DMEM+1 000 μl健康人血清+200 μl丹皮酚母液+10 μl LPS母液;丹皮酚大劑量(320 μg/ml)組：8 590μl DMEM+1 000 μl健康人血清 +400 μl丹皮酚母液 +10 μl LPS 母液。

1.5 Real-time PCR法檢測TLR4 mRNA的表達 EH組、健康人組、不同濃度丹皮酚組細(xì)胞在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后(檢測NF-κB時培養(yǎng)2 h)，采用Trizol法提取各樣品總RNA，測定純度并定量后參照試劑盒使用說明書合成第一鏈cDNA，于PTC-200型梯度PCR儀上42℃反應(yīng)15 min，95℃反應(yīng)2 min。取2 μl cDNA樣本按照10倍梯度稀釋，依次稀釋成共6個濃度梯度的cDNA，制備成陽性定量標(biāo)準(zhǔn)品梯度，倍比稀釋一定要準(zhǔn)確。每次上機必須新鮮配制陽性定量標(biāo)準(zhǔn)品梯度，正式上機時以包含所有樣本的梯度上機進行Real-time PCR反應(yīng)。目的基因TLR4正義鏈引物：5'-TGC AAT GGA TCA AGG ACC AG-3'，反義鏈引物：5'-TGA GGA CCG ACA CAC CAA TG-3'(147 bp)。目的基因IκBa正義鏈引物：5'-CCT GCA CTT GGC CAT CAT C-3'，反義鏈引物：5'-TGC TGC AGG TTG TTC TGG AA-3'(105 bp)。內(nèi)參 β-actin正義鏈引物：5'-GCA TGG GTC AGA AGG ATT CCT-3'，反義鏈引物：5'-TCG TCC CAG TTG GTG ACG AT-3'(106 bp)。反應(yīng)條件為：95℃ 5 s，然后60℃ 20 s，共40循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，由電腦自動生成熒光擴增曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線以及溶解曲線。使用最大二階倒數(shù)法進行分析。

1.6 Western印跡法檢測TLR4、IκBa蛋白的表達 各組細(xì)胞在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)(檢測TLR4時，細(xì)胞培養(yǎng)24 h，檢測IκBa時，細(xì)胞培養(yǎng)1 h)，用細(xì)胞裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取50 μg總蛋白樣品煮沸變性后，SDS-PAGE電泳，隨后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，將膜用雙蒸水漂洗后放入含有封閉液的容器中，室溫下脫色搖床上4℃振蕩過夜。加入用TBS/T稀釋至適當(dāng)濃度的一抗，4℃振蕩過夜。TBS/T洗膜。加入封閉液稀釋的二抗，4℃振蕩過夜，TBS/T洗膜。將膜與ECL反應(yīng)5 min后，曝光、顯影、定影、分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用 SPSS16.0統(tǒng)計軟件包，計量數(shù)據(jù)以s表示，組間比較用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 EH患者和健康人血清處理對TLR4基因表達的影響HUEVC-C用EH患者血清和健康人血清分別培養(yǎng)24 h后，TLR4基因在EH患者組的表達明顯高于健康組〔(8.259 8±0.268 5)×10－4vs(5.416 0 ±0.248 8)×10－4，P ＜0.01〕，說明EH患者組較健康組存在著嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)和免疫紊亂。

2.2 丹皮酚對細(xì)胞TLR4 mRNA表達的影響 見表1。丹皮酚對LPS引起的TLR4高表達有明顯的抑制作用，呈劑量依賴性地阻斷這種反應(yīng)(P＜0.01，P＜0.001)，說明丹皮酚可作為TLR4活化抑制劑，調(diào)控了細(xì)胞內(nèi)TLR4的表達。

表1 丹皮酚對細(xì)胞TLR4 mRNA，IκBa mRNA表達的比較( s，n=30)

表1 丹皮酚對細(xì)胞TLR4 mRNA，IκBa mRNA表達的比較( s，n=30)

與LPS誘導(dǎo)組比較：1)P ＜0.01，2)P ＜0.001

97.356 9±0.959 9 0.066 5±0.000 7丹皮酚小劑量組 10.706 5±0.665 71) 0.097 3±0.000 31)丹皮酚中劑量組 7.199 4±0.093 92) 0.135 7±0.001 62)丹皮酚大劑量組 6.440 3±0.127 12) 0.142 5±0.001 22)Ba LPS誘導(dǎo)組組別 TLR4值( ×10－4)Iκ

2.3 丹皮酚對細(xì)胞 IκBa mRNA表達的影響 見表 1。HUEVC-C用LPS誘導(dǎo)1 h后，IκBa基因表達明顯低于健康組(P＜0.001)，而丹皮酚對LPS引起的IκBa降解有明顯的抑制作用，從而抑制了NF-κB的活化，且呈劑量依賴性，說明丹皮酚可作為NF-κB活化抑制劑，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)NF-κB的表達。

2.4 丹皮酚對細(xì)胞TLR4蛋白表達的影響 見圖1。HUEVCC用LPS誘導(dǎo)24 h后，TLR4蛋白表達明顯高于健康組，而丹皮酚對LPS引起的TLR4高表達有明顯的抑制作用，說明丹皮酚可作為TLR4活化抑制劑，調(diào)控了細(xì)胞內(nèi)TLR4的表達，呈劑量依賴性降低TLR4蛋白的高表達。

2.5 丹皮酚對細(xì)胞IκBa蛋白表達的影響 見圖2。HUEVCC用LPS誘導(dǎo)1 h后，IκBa基因表達明顯低于健康組，而丹皮酚呈劑量依賴性抑制IκBa蛋白的降解。說明丹皮酚可作為IκBa降解的抑制劑，從而抑制了 NF-κB的活化，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)NF-κB 的表達。

圖1 TLR4及β-actin Western印跡結(jié)果

圖2 IκBa及β-actin Western印跡結(jié)果

3 討論

EH的病因及發(fā)病機制至今不明，近年，內(nèi)皮細(xì)胞損傷、炎癥、免疫在EH中的作用日漸受到重視，大量研究表明，EH與血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、炎癥標(biāo)志物、免疫功能障礙改變有關(guān)〔2～8〕，表明內(nèi)皮細(xì)胞損傷、炎癥反應(yīng)和免疫紊亂在EH的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色，為研究EH的發(fā)病機制和治療提供了新的思路?？杀籐PS誘導(dǎo)的TLR-NF-κB信號途徑，最突出的生物學(xué)功能就是促進細(xì)胞因子合成與釋放，參與炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)，在內(nèi)皮細(xì)胞參與的炎癥免疫反應(yīng)中表達并發(fā)揮作用，因此加深TLR信號系統(tǒng)在EH中作用的理解，可能幫助我們了解EH的發(fā)病機制。EH與內(nèi)皮細(xì)胞損傷、炎癥、免疫以及TLR-NF-κB信號途徑之間存在共同的交叉點，我們的前期研究也證明EH患者血清可致內(nèi)皮細(xì)胞損傷〔9〕，而系列藥物都可以降低與炎癥免疫密切相關(guān)的黏附分子表達〔10～12〕，有內(nèi)皮細(xì)胞保護作用。因為NF-κB的激活可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的表達，所以我們認(rèn)為這類藥物可能作用于TLR-NF-κB信號途徑而引起黏附分子表達下降。本結(jié)果說明EH患者組較健康組存在著嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)和免疫紊亂。

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