金藝鳳 蔣靜涵 黃群聯 王 瑩 劉東華 (皖南醫(yī)學院附屬弋磯山醫(yī)院呼吸內科，安徽 蕪湖 400)

治療晚期非小細胞肺癌(NSCLC)的主要手段之一是采用以鉑類藥物為基礎的聯合化療，但不同個體對其敏感性差異較大，預后也不同。其中，DNA修復能力是影響療效的重要原因〔1〕。核苷酸切除修復途徑是鉑類藥物引起DNA損傷的主要修復途徑，切除修復交叉互補基因1(ERCC1)和著色性干皮病基因D(XPD)在核苷酸切除修復中起著重要作用。本文采用DNA測序和限制性酶切片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)兩種方法檢測晚期NSCLC患者ERCC1和XPD基因型，研究不同基因型與NSCLC患者應用含鉑方案化療后生存期之間的關系，探討ERCC1和XPD的單核苷酸多態(tài)性(SNP)是否可以作為預測鉑類藥物化療預后的指標，為腫瘤的個體化治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 對象 73例NSCLC患者選自2007年11月至2009年11月皖南醫(yī)學院附屬弋磯山醫(yī)院住院患者，均經病理學或細胞學確診。其中男59例，女14例;年齡24～82〔平均(52.7±18.9)〕歲，≤60歲22例，＞60歲51例;鱗狀細胞癌42例，腺癌29例，差分化癌2例;按1988年國際肺癌分期標準：Ⅲ期26例，Ⅳ期47例?；颊呔汣T掃描具有可測量的腫瘤病灶，化療前檢測血常規(guī)、肝腎功能均正常，心電圖無明顯異常，卡氏功能狀況評分均＞60分。所有病例均于化療前抽取外周靜脈血2 ml，置于乙二胺四乙酸鈉(EDTA)抗凝管，凍存于 －20℃冰柜。

1.2 方法

1.2.1 化療方案及療效評價 所有患者化療前簽署化療知情同意書，接受以順鉑(cisplatin，DDP)為基礎的化療。具體方案：DDP/紫杉醇(15 例)、DDP/長春瑞濱(11 例)、DDP/吉西他濱(34例)、DDP/多西紫杉醇(13例)。具體用法：DDP 30 mg/m2，第2 ～4 天;長春瑞濱(Navelbine)25 mg/m2，第 1、8天;吉西他濱(Gemcitabine)1 000 mg/m2，第1、8 天;紫杉醇(paclitaxel)175 mg/m2，第1天(維持3 h);多西紫杉醇(docetaxel)60 mg/m2，第1天(維持1 h);均經靜脈滴注。上述治療方案每3～4 w重復，均在2～3個周期后評價療效。療效評價參照WHO實體瘤(1981年)標準分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、穩(wěn)定(SD)和進展(PD)。以 CR +PR +SD為臨床獲益。

1.2.2 臨床評價 總生存期(OS)為最終評價指標。OS為從確診日起至患者死亡(死于原發(fā)腫瘤或并發(fā)癥)的日期;在數據截止尚生存的患者，以末次隨訪時間作為截尾數據進行分析。

1.2.3 DNA抽提擴增 采用標準酚-氯仿提取法抽提外周靜脈血DNA〔2〕。4℃保存?zhèn)溆?。引物參照文獻設計(表1)，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。PCR總反應體積50 μl：模板 DNA 2 μl，Taq 酶 2.5 U，10 × buffer 5 μl，MgCl21.5 mmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L。上 游 及 下 游 引 物 各10 pmol/L，加ddH2O至總體積50 μl。反應在PTC-150型熱循環(huán)儀(美國MJ公司)上進行，98℃ 5 min蛋白變性后，加入Taq酶(TIANGEN公司產品)，進入熱循環(huán)。ERCC1反應條件為：94℃變性30 s;56℃退火30 s;72℃ 延伸1 min，共33個循環(huán)，最后72℃延伸4 min。XPD反應條件為：94℃變性30 s;59℃退火30 s;72℃延伸1 min，共33個循環(huán)，最后72℃延伸4 min。取10 μl PCR擴增產物加樣，1.5%瓊脂糖凝膠電泳60 min(電壓100 V)，溴乙啶(EB)染色，紫外燈下檢測擴增產物，數碼相機攝片保存，PCR產物4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 PCR擴增引物、退火溫度、PCR產物大小

1.2.4 基因分型

1.2.4.1 DNA測序 PCR產物經DNA凝膠純化試劑盒(Axygen公司產品)純化回收，30 μl純化后的 PCR產物連同其上游引物由南京金斯瑞生物科技有限公司采用雙脫氧法在ABI-3730XL測序儀上進行單向測序。

1.2.4.2 PCR-RFLP法進行基因型分析 取10 μl ERCC1 C118T的PCR純化產物與2 μl BsrDⅠ(New England BioLabs公司)65℃水浴消化4 h，8 μl XPD Lys751Gln的PCR純化產物與2 μl限制性核酸內切酶Pst I(New England BioLabs公司)于37℃水浴消化3 h，用2.0%瓊脂糖凝膠電泳分離酶切片段，80 V電泳40 min，EB染色確定各基因型。同時，為保證基因分型的準確性，隨機挑選10例(13.7%)進行重復實驗。

1.3 統計學方法 應用SPSS16.0統計軟件進行分析，采用Kaplan-Meier法進行單因素生存分析、χ2檢驗和Log-rank檢驗。

2 結果

2.1 ERCC1、XPD基因型與臨床特征的關系 患者性別、年齡、不同的組織學類型和臨床分期間ERCC1、XPD基因型差異無統計學意義。見表2。

2.2 測序結果與PCR-RFLP方法結果 ERCC1 C118T、XPD Lys751Gln DNA測序結果與PCR-RFLP法結果圖一致，且各等位基因符合Hardy-Weinberg平衡定律。見圖1～圖7。

圖1顯示在ERCC1 C118T多態(tài)性位點堿基C沒有發(fā)生突變，只有 C一個波峰;PCR-RFLP法顯示1個片段(199 bp)，為C/C基因型。圖2顯示ERCC1 C118T多態(tài)性位點已突變?yōu)閴A基T，只有 T一個波峰;PCR-RFLP法顯示2個片段(120和79 bp)，為T/T基因型。圖3顯示在ERCC1 C118T多態(tài)性位點有堿基 C和 T兩個波峰出現;PCR-RFLP法顯示3個片段(199、120和 79 bp)為 C/T基因型。圖 4顯示在 XPD Lys751Gln多態(tài)性位點堿基A沒有突變，只有A一個波峰;PCR-RFLP法顯示2個片段(189、131 bp)，為A/A(Lys/Lys)基因型。圖5顯示在XPD Lys751Gln1多態(tài)性位點一處堿基A沒有突變，只有A一個波峰;另一處堿基A和 C兩個波峰出現;PCR-RFLP法顯示4個片段(189、131、126和 63 bp)，為 A/C(Lys/Gln)基因型。本研究中未發(fā)現C/C(Gln/Gln)基因型。

表2 患者一般情況與ERCC1、XPD基因型的關系〔n(%)〕

2.3 ERCC1、XPD基因型分布 73例晚期 NSCLC ERCC1 C118T存在三種等位基因型，其基因頻率分別為：C/C型基因頻率53.4%(39/73)，C/T型基因頻率 38.4%(28/73)，T/T型基因頻率8.2%(6/73)。本研究只檢測到XPD Lys751Gln兩種等位基因型，其基因頻率分別為：A/A型83.6%(61/73)，A/C型16.4%(12/73)，未檢測到純合基因突變型C/C型。

2.4 ERCC1和XPD基因型與NSCLC患者臨床預后的關系隨訪截止時間為2011年9月，全部患者中位生存期為18個月。ERCC1 C118T CC型中位生存期〔(19.803±4.604)個月〕與CT型中位生存期〔(15.993±4.283)個月〕、TT型中位生存期〔(16.233±1.369)個月〕之間的差異有統計學意義(χ2=12.855，P=0.000;(χ2=8.602，P=0.003);而 CT 型中位生存期與TT型中位生存期差異無統計學意義(χ2=0.701，P=0.402)。XPD A/A型中位生存期、A/C型中位生存期〔(18.044±4.831)、(18.075±4.667)個月〕差異無統計學意義(χ2=0.034，P=0.854)。見圖 8，圖 9。

圖1 ERCC1 C118T C/C基因型測序

圖2 ERCC1 C118T T/T基因型測序

圖3 ERCC1 C118T C/T基因型測序

圖4 XPD密碼子751 A/A基因型測序

圖5 XPD密碼子Lys751Gln A/C基因型測序

圖6 ERCC1 C118T經限制性內切酶BsrD I作用后的瓊脂糖凝膠電泳圖

圖7 XPD Lys751Gln經限限制性內切酶Pst I作用后的瓊脂糖凝膠電泳圖

圖8 ERCC1不同基因型的NSCLC患者總生存期生存曲線

圖9 XPD不同基因型的NSCLC患者總生存期生存曲線

3 討論

循證醫(yī)學研究證實，NSCLC的化療以鉑類為基礎，含鉑方案優(yōu)于不含鉑方案〔3〕。已有研究表明各種以鉑類為基礎的聯合方案在有效率和生存期上均無顯著差異〔4〕，但患者對它們的敏感性差異顯著，預后也不同。藥理遺傳學和基因組學研究表明，腫瘤基因的SNP及其分子表達水平與化療療效和毒性反應密切相關。

ERCC1基因的表達產物與DNA修復酶缺乏互補基因F(XPF)形成緊密的ERCC1-XPF異二聚體，是特異性的核酸內切酶，具有識別和切除 DNA 5'端的雙重作用〔5〕。ERCC1 C118T可發(fā)生核苷酸 C→T改變，雖然兩者編碼的都是天門冬氨酸(asparagine，Asn)，但C→T轉換可能與密碼子選擇減半、ERCC1 mRNA產物及隨后的蛋白翻譯降低有關，降低了DNA修復能力(DNA repair capacity，DRC)〔6〕。

本研究顯示，NSCLC患者外周血中ERCC1 C118T C/C型的總生存時間較C/T型、T/T型延長，提示ERCC1 C118T C/C型的NSCLC患者接受以鉑類為基礎的化療可能生存獲益。這個結果與Su等〔7〕研究結果一致。錢曉萍等〔8〕研究腫瘤石蠟組織中ERCC1 codon118 SNP與接受鉑類藥物化療NSCLC患者臨床預后之間的關系，結果顯示C/C基因型患者的中位生存時間為25.0個月，而C/T及T/T基因型患者的中位生存時間僅為10.5個月，兩者有統計學差異，認為ERCC1 codon118基因SNP可作為判斷NSCLC患者鉑類藥物化療的預后指標。而Zhou等〔9〕研究結果顯示攜帶ERCC1 C118T C/T型、T/T型患者的總生存期較C/C型明顯延長(17.5個月、13.5個月)。究其原因，可能與病理分期以Ⅳ期為主有關，有必要加大樣本量進一步研究證實ERCC1基因型與臨床預后的關系。

XPD基因產物具有ATP依賴的5'→3'DNA解旋酶活性。XPD蛋白是轉錄因子復合物Ⅱ型轉錄因子H(transcription factorⅡH，TFⅡH)的核心組分，并且參與核苷酸切除修復和基因轉錄過程〔10〕。XPD在DNA修復過程中通過NER途徑去除多種因素導致的DNA損傷(如：鉑-DNA加合物)來發(fā)揮作用。該基因第751密碼子A→C改變導致Lys→Gln氨基酸替代。Lys751Gln(A→C)為有義突變導致氨基酸改變，從而影響DNA修復途徑。本研究顯示XPD Lys751Gln A/A型的中位總生存時間與A/C型比較差異無統計學意義，與陳君臣等〔11〕的研究結果一致。

綜上所述，本研究證實ERCC1 C118T多態(tài)性與NSCLC患者鉑類藥物化療后的生存期有關，在一定程度上可作為鉑類藥物化療后生存期的預測指標。

1 魏 嘉，劉寶瑞.DNA修復基因單核苷酸多態(tài)性與鉑類藥物抵抗研究進展〔J〕.中華腫瘤雜志，2006;28(3)：161-3.

2 黃培堂譯.分子克隆實驗指南〔M〕.第3版.北京：科學出版社，2002：467-70.

3 D＇Addario G，Pintilie M，Leighl NB，et al.Platinum-based versus non-platinum-based chemotherapy in advanced non-small-cell lung cancer：a meta-analysis of the published literature〔J〕.J Clin Oncol，2005;23(13)：2926-36.

4 Smit EF，van Meerbeeck JP，Lianes P，et al.Three-arm randomized study of two cisplatin-based regimens and paclitaxel plus gemcitabine in advanced non-small-cell lung cancer：a phase Ⅲ trial of the European Organization for Research and Treatment of Cancer Lung Cancer Group-EORTC 08975〔J〕.J Clin Oncol，2003;21(21)：3909-17.

5 Takenaka T，Yoshino I，Kouso H，et al.Combined evaluation of Rad51 and ERCC1 expressions for sensitivity to platinum agents in non-small cell lung cancer〔J〕.Int J Cancer，2007;121(4)：895-900.

6 Viguier J，Boige V，Miquel C，et al.ERCC1 codon 118 polymorphism is a predictive factor for the tumor response to oxaliplatin，5-fluorouracil combination chemotherapy in patients with advanced colorectal cancer〔J〕.Clin Cancer Res，2005;11(17)：6212-7.

7 Su D，Ma S，Liu P，et al.Genetic polymorphisms and treatment response in advanced non-small cell lung cancer〔J〕.Lung Cancer，2007;56(2)：281-8.

8 錢曉萍，劉寶瑞，嚴文躍，等.ERCC1codon118單核苷酸多態(tài)性與小細胞肺癌鉑類化療的臨床預后研究〔J〕.現代腫瘤醫(yī)學，2011;19(10)：1997-2001.

9 Zhou C，Ren S，Zhou S，et al.Predictive effects of ERCC1 and XRCC3 SNP on efficacy of platinum-based chemotherapy in advanced NSCLC patients〔J〕.Jpn J Clin Oncol，2010;40(10)：954-60.

10 Giachino DF，Ghio P，Regazzoni S，et al.Prospective assessment of XPD Lys751Gln and XRCC1 Arg399Gln single nucleotide polymorphisms in lung cancer〔J〕.Clin Cancer Res，2007;13(10)：2876-81.

11 陳君臣，劉志良，成 健，等.XPD基因單核苷酸多態(tài)性與晚期非小細胞肺癌對鉑類藥物敏感性的關系〔J〕.中國老年學雜志，2011;31(7)：1114-7.