李寶善 王艷嬌 馬厚勛 吳 平 (重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院老年病科，重慶 400016)

小鼠全長膜型Klotho蛋白cDNA表達(dá)體系的構(gòu)建與應(yīng)用

李寶善 王艷嬌 馬厚勛 吳 平 (重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院老年病科，重慶 400016)

目的 克隆編碼小鼠膜型Klotho(mKL)蛋白的cDNA片段，構(gòu)建、包裝Klotho重組腺相關(guān)病毒表達(dá)體系，并檢測rAAV/mKL載體表達(dá)功能。方法 選擇RT-PCR擴(kuò)增小鼠全長mKL蛋白的基因片段，將該片段亞克隆至腺相關(guān)病毒載體pAAV-IRES-hnGFP，采用酶切及DNA測序鑒定;利用AAV-293細(xì)胞包裝rAAV/mKL，經(jīng)轉(zhuǎn)染7901細(xì)胞，檢測其Klotho表達(dá)情況。結(jié)果 本文成功克隆出序列信息和讀碼框完全正確的3 064 bp的小鼠Klotho基因片段，并構(gòu)建pAAV/mKL克隆。在AAV-293細(xì)胞中包裝出rAAV/mKL，病毒原液轉(zhuǎn)染7901細(xì)胞后其Klotho mRNA表達(dá)上調(diào)，而細(xì)胞上清液Klotho蛋白也明顯增加(P＜0.01)。結(jié)論 成功構(gòu)建小鼠Klotho重組腺相關(guān)病毒載體(pAAV/mKL)，獲得了rAAV/mKL，并經(jīng)轉(zhuǎn)染7901細(xì)胞驗(yàn)證其基因表達(dá)功能正常，這就為進(jìn)一步研究Klotho基因治療衰老相關(guān)性疾病提供了技術(shù)基礎(chǔ)。

Klotho;基因克隆;腺相關(guān)病毒;載體構(gòu)建;病毒包裝

目前研究證實(shí)分泌型的KL蛋白實(shí)質(zhì)上是膜型KL蛋白細(xì)胞外區(qū)可被錨定在細(xì)胞膜上的如ADAM10和ADAM17等金屬蛋白酶水解脫落而產(chǎn)生的〔1，2〕，其作為一種循環(huán)因子或激素，可抑制細(xì)胞內(nèi)胰島素/胰島素樣生長因子-1(insulin/IGF-1)信號(hào)級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)〔3〕，而Klotho蛋白抑制胰島素、胰島素樣生長因子-1(IGF-1)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力可能與其抗衰老特性有關(guān)。另外分泌型klotho還具有調(diào)節(jié)離子通道活性，抑制氧化應(yīng)激、抑制Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及增加一氧化氮合成等作用〔4，5〕。新近國外研究證實(shí)在自發(fā)性高血壓大鼠應(yīng)用全長Klotho cDNA腺相關(guān)病毒遞送能夠阻止其病程進(jìn)展和血壓增高以及腎臟損害〔6〕，其作用可能是通過增加Klotho表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的，這提示重組Klotho cDNA腺相關(guān)病毒載體轉(zhuǎn)染可為高血壓長期控制和腎臟保護(hù)治療提供一條新途徑?，F(xiàn)有研究證實(shí)分泌型的Klotho蛋白實(shí)質(zhì)上就是全長膜型Klotho蛋白(mKL)蛋白細(xì)胞外區(qū)的水解脫落成分，為此，本研究擬通過采用更優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)方法克隆編碼mKL蛋白cDNA，并構(gòu)建其重組腺相關(guān)病毒載體，以便為后續(xù)研究Klotho基因治療高血壓、2型糖尿病、原發(fā)性骨質(zhì)疏松等衰老相關(guān)性疾病提供技術(shù)條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 小鼠及質(zhì)粒載體和菌株 5周齡昆明小鼠購自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。pMD19-T載體由TaKaRa公司生產(chǎn)，腺相關(guān)病毒質(zhì)粒載體 pAAV-IRES-HnGFP、AAV-RC、AAV-Helper為Stratagene公司產(chǎn)品。TOP10感受態(tài)細(xì)胞為重慶市眼科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑 PCR產(chǎn)物加A尾試劑盒、DNA Marker、T4 DNA連接酶為TakaRa公司產(chǎn)品，膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)mega公司，PCR引物由上海生工生物工程公司合成?；驕y序由上海英濰捷基公司、寶生物(大連)公司完成。Lipofectamine 2000購自英濰捷基(上海)公司，DMEM高糖培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自Hyclone公司。小鼠Klotho蛋白ELISA試劑盒為R＆D分裝產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 Nano Drop2000微量分光光度計(jì)(Thermo)，s1000 PCR儀、DNA電泳凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)，Leica ebq100倒置熒光顯微鏡，HEPA Class100恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo)。本實(shí)驗(yàn)研究所需的實(shí)驗(yàn)場地及儀器均為重慶市眼科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

根據(jù)分子生物學(xué)技術(shù)方法并在國內(nèi)趙景宏等〔7〕文獻(xiàn)報(bào)道的兩步法基礎(chǔ)上，建立和完善了更有效、切合實(shí)際、條件優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法與操作規(guī)程，確保本實(shí)驗(yàn)方法的可行性。

1.2.1 小鼠的腎臟組織總RNA提取 取約100 mg小鼠腎臟組織按RNAiso Plus說明書提取總RNA，并溶于DEPC處理水。

1.2.2 克隆編碼小鼠全長mKL蛋白的基因 用小鼠的腎臟組織總RNA，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增Klotho基因序列。根據(jù)本研究需要設(shè)計(jì)PCR的特異性上游引物序列為：5'ccggaattcctagcccg-3'(斜體下劃線部分為EcoR I酶切位點(diǎn)，黑體加框部分為翻譯起始密碼子)，特異性下游引物序列為：5'gccgctcgagcttataacttctc 3'(斜體下劃線部分為Xho I酶切位點(diǎn)，黑體加框部分為翻譯終止密碼子)(NM_013823.2)，其PCR產(chǎn)物長度為3 064 bp;并選擇大鼠β-actin mRNA(NM_013823.2)為本研究PCR實(shí)驗(yàn)內(nèi)參，上游引物序列為：5'GCGACGAGGCCCAGAGCAAG 3';下游引物序列為：5'TGGAGGGGCCGGACTCATCG 3'，PCR產(chǎn)物長度為942 bp。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定片段大小，膠回收PCR產(chǎn)物，加A尾，連接pMD19-T載體送上海英濰捷基公司進(jìn)行DNA測序。

1.2.3 編碼小鼠mKL蛋白的全長cDNA片段的獲得 將測序結(jié)果正確的pMD19-T/mKL EcoR I/Xho I雙酶切。膠回收3 kb左右條帶，即為mKL cDNA片段，置pH7.5 TE緩沖液中，－20℃保存。

1.2.4 重組pAAV/mKL質(zhì)粒的構(gòu)建 應(yīng)用EcoR I/Xho I對(duì)腺相關(guān)病毒空載體pAAV-IRES-HnGFP進(jìn)行雙酶切，膠回收目的片段，然后將酶切后載體與之前酶切回收mKL cDNA片段按1∶10(摩爾數(shù)比)進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)過夜。

1.2.5 重組pAAV/mKL質(zhì)粒的篩選與鑒定 經(jīng)含氨芐青霉素抗性篩選，挑取單菌落振蕩培養(yǎng)過夜后提取質(zhì)粒，通過EcoR I/Xho I酶切對(duì)重組質(zhì)粒pAAV/mKL進(jìn)行鑒定。最終將鑒定陽性重組質(zhì)粒送寶生物生物工程公司進(jìn)行DNA測序，測序結(jié)果與GenBank中所報(bào)道目的基因序列進(jìn)行比對(duì)分析。

1.2.6 重組rAAV/mKL病毒包裝 AAV Helper-Free System試劑盒推薦用2×HBS+0.3 M CaCl2即磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)染技術(shù)，而本實(shí)驗(yàn)研究通過探索、優(yōu)化轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)條件，發(fā)現(xiàn)采用Lipofectamine 2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染方法，其轉(zhuǎn)染率及包裝效率能得到顯著提高。

1.2.7 rAAV/mKL轉(zhuǎn)染7901細(xì)胞后其KL mRNA表達(dá) 在12孔板用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)7901細(xì)胞，待細(xì)胞融合到80%，換含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，加含rAAV/mKL病毒原液200 μl，2 h后換為10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，48 h后收集細(xì)胞，按RNAiso Plus說明書提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄，用Premix Taq酶PCR驗(yàn)證Klotho基因表達(dá)，所用上、下游PCR引物序列分別為 5'GGGTCACTGGGTCAATCT 3'和 5'GCAAAGTAGCCACAAAGG-3'(NM_013823.2)，PCR產(chǎn)物長度為710 bp。內(nèi)參同前。

1.2.8 rAAV/mKL轉(zhuǎn)染7901細(xì)胞后其KL蛋白表達(dá) 在12孔板用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)7901細(xì)胞，待細(xì)胞融合到80%，換含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，加含rAAV/mKL病毒原液200 μl，2 h后換為10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，48 h后收集細(xì)胞上清液，按ELISA試劑盒說明操作。重復(fù)5次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 編碼小鼠全長mKL蛋白的基因克隆與鑒定

通過對(duì)PCR的退火溫度進(jìn)行梯度篩選，結(jié)果顯示在退火溫度為56℃條件時(shí)其特異的DNA片段擴(kuò)增效果最好，為此，本研究選用56℃為退火溫度條件，其所得PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示其產(chǎn)物長度約3 000 bp，與預(yù)期目的片段大小一致(見圖1)。通過回收PCR產(chǎn)物，加A尾后，與pMD19-T載體進(jìn)行連接、再擴(kuò)增，并經(jīng)EcoR I/Xho I酶切，其產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示目的片段成功克隆至pMD19-T即提示載體構(gòu)建獲得成功，隨后DNA測序檢測結(jié)果也表明所擴(kuò)增的DNA片段序列與小鼠膜型Klotho mRNA基因序列完全一致。見圖1。

2.2 編碼小鼠全長mKL蛋白cDNA片段的獲得

將測序結(jié)果正確的pMD19-T/mKL質(zhì)粒EcoR I/Xho I雙酶切，電泳結(jié)果可見大小約2 670 bp的pMD19-T片段和約3 kb的mKL cDNA，膠回收約3 kb條帶，獲得了編碼小鼠膜型Klotho蛋白的全長cDNA片段。

2.3 重組pAAV/mKL質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

經(jīng)過酶切、連接、轉(zhuǎn)化和氨芐青霉素抗性篩選，提取質(zhì)粒后酶切鑒定，獲得陽性重組質(zhì)粒pAAV/mKL。測序結(jié)果顯示，質(zhì)粒中含有與GenBank和文獻(xiàn)報(bào)道序列一致且讀碼框完全正確的小鼠全長膜型Klotho cDNA序列，表明小鼠膜型全長Klotho重組腺相關(guān)病毒載體構(gòu)建成功。見圖1。

2.4 重組AAV/mKL病毒包裝

本研究將AAV-RC、AAVHelper、pAAV/mKL三質(zhì)粒等比例與Lipofectamine 2000共轉(zhuǎn)染AAV-293細(xì)胞。其結(jié)果顯示48 h后可見綠色熒光表達(dá)即提示有病毒產(chǎn)生，72 h后綠色熒光最為明顯，并有部分熒光淬滅(見圖2)。

2.5 rAAV/mKL轉(zhuǎn)染7901細(xì)胞后Klotho mRNA表達(dá)情況

病毒原液轉(zhuǎn)染7901細(xì)胞48 h后收集細(xì)胞，提取總RNA。其結(jié)果顯示病毒轉(zhuǎn)染后7901細(xì)胞的Klotho基因mRNA表達(dá)顯著增加，見圖1。

2.6 rAAV/mKL轉(zhuǎn)染7901細(xì)胞后Klotho蛋白表達(dá)情況

病毒原液轉(zhuǎn)染7901細(xì)胞48 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，應(yīng)用ELISA法檢測培養(yǎng)上清液中分泌型Klotho蛋白(來源于膜型Klotho蛋白脫落入培養(yǎng)液中部分)。其結(jié)果顯示病毒原液轉(zhuǎn)染組：(75.52±7.02)U/L，空白對(duì)照組：(46.78 ±2.64)U/L;即病毒原液轉(zhuǎn)染組較空白對(duì)照組分泌型Klotho蛋白明顯升高，有顯著性差異(P=0.003)。

圖1 PCR、酶切后凝膠電泳圖

圖2 共轉(zhuǎn)染AAV-293細(xì)胞后GFP表達(dá)情況(×100)

3 討論

Klotho基因是新近研究發(fā)現(xiàn)的一種與壽命和各種衰老相關(guān)表型(如心血管疾病、肺氣腫、骨質(zhì)疏松等)相關(guān)的基因，而目前有關(guān)Klotho基因與人類疾病的關(guān)系也在不斷探索中。

基于本實(shí)驗(yàn)涉及Klotho基因片段較長，超過3 000 bp，而在現(xiàn)有的文獻(xiàn)中對(duì)超長片段基因的高保真克隆方法報(bào)道甚少。為此，本實(shí)驗(yàn)在傳統(tǒng)兩步RT-PCR法基礎(chǔ)上通過改良優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方法，實(shí)現(xiàn)了超長片段基因的膜型Klotho蛋白cDNA克隆之目的。

眾所周知pAAV-IRES-HnGFP質(zhì)粒構(gòu)建時(shí)，如果插入片段過長會(huì)影響AAV的轉(zhuǎn)染效率(如pAAV-IRES-HnGFP質(zhì)粒說明書中推薦插入片段常不超過1 700 bp)。本實(shí)驗(yàn)研究采用Stratagene公司AAV Helper-Free System腺相關(guān)病毒包裝試劑盒(即包括AAV-RC、AAV-Helper兩種質(zhì)粒)和自行構(gòu)建的含全長膜型Klotho cDNA及HnGFP的pAAV/mKL三種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染AAV-293細(xì)胞、包裝病毒時(shí)發(fā)現(xiàn)該試劑盒所推薦的2×HBS+0.3 mol/L CaCl2對(duì)本實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞存活率影響較大，為此，本研究通過探索、優(yōu)化和篩選轉(zhuǎn)染條件，最終確定采用 Lipofectamine 2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染方法，能得到顯著提高其轉(zhuǎn)染率及包裝效率，為本研究實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行提供了技術(shù)方法。

近年來，學(xué)者對(duì)基因治療心血管性疾病進(jìn)行了較多研究〔8〕，而病毒載體的選擇對(duì)后續(xù)基因治療研究也致關(guān)重要。如腺病毒載體因?yàn)槠渥畲罂蓴y帶7.5 kb的外源基因，轉(zhuǎn)染效率高、靶器官廣泛等優(yōu)點(diǎn)應(yīng)用最多;但是腺病毒載體轉(zhuǎn)染的基因表達(dá)時(shí)間短，大約為2～3 w，免疫反應(yīng)大，不適合慢性疾病的防治。而腺相關(guān)病毒因?yàn)槟芏c(diǎn)整合到宿染色體19q13.3的特定DNA上，其攜帶的外源基因表達(dá)穩(wěn)定，持續(xù)時(shí)間長，具有廣闊的宿主細(xì)胞譜〔9〕，且引起免疫反應(yīng)輕〔10〕。

本實(shí)驗(yàn)選擇腺相關(guān)病毒為后續(xù)基因治療的載體，通過克隆獲得編碼小鼠全長mKL的cDNA片段，并將其裝載至腺相關(guān)病毒載體之中，獲得了含超長cDNA片段的rAAV/mKL病毒載體;并通過病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞驗(yàn)證其具有表達(dá)Klotho mRNA及蛋白功能，這為構(gòu)建rAAV/mKL載體應(yīng)用于高血壓、糖尿病、骨質(zhì)疏松等衰老相關(guān)疾病中的干預(yù)研究提供了技術(shù)條件及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 Chen CD，Podvin S，Gillespie E，Leeman SE，Abraham CR.Insulin stimulates the cleavage and release of the extracellular domain of Klotho by ADAM10 and ADAM17〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2007;104(50)：19796-801.

2 Bloch L，Sineshchekova O，Reichenbach D，Reiss K，Saftig P，Kuro-o M，Kaether CKlotho is a substrate for alpha-，beta-and gamma-secretase〔J〕.FEBS Lett，2009;583(19)：3221-4.

3 Torres PU，Prié D，Molina-Blétry V，et al.Klotho：an antiaging protein involved in mineral and vitamin D metabolism〔J〕.Kidney Int，2007;71(8)：730-7.

4 Kawaguchi H，Manabe N，Miyaura C，et al.Independent impairment of osteoblast and osteoclast differentiation in klotho mouse exhibiting low-turnover osteopenia〔J〕.J Clin Invest，1999;104：229-37.

5 Liu H，F(xiàn)ergusson MM，Castilho RM，et al.Augmented Wnt signaling in a mammalian model of accelerated aging〔J〕.Science，2007;317：803-6.

6 Yuhong Wang，Zhong jie Sun.Klotho Gene Delivery Prevents Progression of Spontaneous Hypertension〔J〕.Hypertension，2009;54：810-17.

7 趙景宏，王軍平，陳 默.編碼小鼠分泌型Klotho蛋白的cDNA克隆及其重組腺相關(guān)病毒載體構(gòu)建〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2009;29(19)：2452-5.

8 Jones WS，Annex BH.Growth factors for therapeutic angiogenesis in peripheral arterial disease〔J〕.Curr Opin Cardiol，2007;22(5)：458-63.

9 《中國組織工程研究與臨床康復(fù)》雜志社學(xué)術(shù)部，基因治療及轉(zhuǎn)基因技術(shù)與組織工程〔J〕.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2010;12(24)：4484-5.

10 Barquinero J，Eixarch H，Perez-Melgosa M.Retroviral vectors：new applications for an old tool〔J〕.Gene Ther，2004;11(Suppl1)：3-9.

Construction of the express system carrying the full length cDNA fragment coding mouse membrane-form klotho protein and its application

LI Bao-Shan，WANG Yan-Jiao，MA Hou-Xun，et al.
Department of Gerontics，the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical Unversity，Chongqing 400016，China

Objective To clone the full length of cDNA fragment coding mouse membrane form klotho(mKL)protein and construct the recombinant adeno-associated virus(rAAV)vector carrying the open reading frame(ORF)of the membrane form Klotho protein(pAAV/mKL)and package the virus.The expression of Klotho mRNA and Klotho protein in 7901 cell was tested after rAAV/mKL transfection.Methods The full length of cDNA fragment coding mouse membrane form klotho protein was amplified by reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR).After digestion，ligation and transformation，the targeted cDNA fragment was sub-cloned into pAAVIRES-hnGFP vector in order to construct the recombinant plasmid pAAV/mKL.The pAAV/mKL was verified by restricted digestion and DNA sequencing.Use the AAV-293 cell to package rAAV/mKL and later transfect it into the 7901 cell.Then detect the expression of Klotho by RT-PCR and ELISA.Results The cDNA fragment with 3 064 bp coding membrane form Klotho protein was obtained by PCR amplification，the sequence of it was identical by GenBank.The rAAV/mKL was packaged in AAV-293 cell successfully.After transfection by rAAV/mKL，the expression of Klotho mRNA in 7901 cell was increased，and Klotho protein in the supernate of cultured cells significantly upregulated(P＜0.01).Conclusions The rAAV/mKL carrying the full length of cDNA fragment which coding mouse membrane form klotho protein is successfully constructed and packaged in AAV-293 cells，and transfecting it into the 7901 cell verifies it's function of gene express.All of these will pave a road for the deep research of gene therapy for aging related diseases.

Klotho;Gene clone;Adeno-associated virus;Vector construction;Virus package

R393

〕 A

1005-9202(2012)02-0291-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.02.033

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(30672212);重慶市衛(wèi)生局醫(yī)學(xué)科研計(jì)劃項(xiàng)目(No.2010-2-079)

馬厚勛(1966-)，男，教授，主任醫(yī)師，主要從事老年心血管病基礎(chǔ)與臨床。

李寶善(1984-)，男，在讀碩士，主要從事老年心血管病基礎(chǔ)與臨床。

〔2011-08-09收稿 2011-11-17修回〕

(編輯 曹夢園)