黃玉娥 李愛玲 羅偉強(qiáng) 高妙萍 陳國(guó)剛

（1 廣州醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院藥劑科，廣東 廣州510150；2 廣州市荔灣區(qū)第三人民醫(yī)院藥劑科，廣東 廣州510380；3 廣州市胸科醫(yī)院藥劑科，廣東 廣州510095）

人類進(jìn)入工業(yè)化時(shí)代以來(lái)，惡性腫瘤尤其是肺癌，一直都威脅 著人類的健康。它5年生存率約為15%，其發(fā)病率及病死率仍在不斷上升[1]。目前臨床上對(duì)于肺癌的治療并無(wú)理想的治療手段，大多數(shù)采用化療或放療，在治療的同時(shí)對(duì)人體將會(huì)產(chǎn)生巨大的副作用，如抑制人體白細(xì)胞數(shù)目，降低人體抗感染的能力等。有研究表明，經(jīng)過(guò)三維放療治療的患者中仍然有30%左右出現(xiàn)不同程度的肺損傷[2]。化療療效肯定，但它毒副作用廣泛且嚴(yán)重，對(duì)腫瘤患者的恢復(fù)極其不利，也損害了機(jī)體的免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致腫瘤可能復(fù)發(fā)。近年來(lái)的生物靶向治療藥物雖然特異性強(qiáng)，不良反應(yīng)低。但它價(jià)格昂貴。近年來(lái)中醫(yī)在防治腫瘤方面的優(yōu)勢(shì)逐漸明顯，中醫(yī)西醫(yī)相輔相成，充分發(fā)揮我國(guó)獨(dú)有的防癌治癌特色和優(yōu)勢(shì)，延長(zhǎng)生存期的目的[3,4]。

黃芪扶正湯這一經(jīng)驗(yàn)方由黃芪、黃精、構(gòu)祀、女貞子和靈芝組成，該五味中藥均能不同程度的提高機(jī)體的免疫能力，但是未見該經(jīng)驗(yàn)方用于抗肺腫瘤方面的報(bào)道。為了驗(yàn)證該方的抗腫瘤作用，我們以Lewis肺癌荷瘤小鼠為模型，觀察其對(duì)腫瘤的發(fā)生以及轉(zhuǎn)移的抑制作用，并比較該方對(duì)化療藥的減毒作用，為開發(fā)本方藥新用途提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞

近交es7BL/6純系6～8周齡雄性小鼠（sPF級(jí)）46只，體質(zhì)量介于16～20g，購(gòu)于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，合格證號(hào)：粵實(shí)動(dòng)證字2010034號(hào)。小鼠Lewis肺癌細(xì)胞株，購(gòu)于中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心實(shí)驗(yàn)室。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物和試劑

采用黃芪、黃精、構(gòu)祀、女貞子和靈芝按比例2∶1∶1∶1∶1制備黃芪扶正湯。組分各種藥物均為同一批次統(tǒng)一購(gòu)于本院中藥房。采用水浸泡法，煮沸法等，得到粉劑放入4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｓ蒙睇}水將順鉑（齊魯制藥有限公司）配置為0.2mg/mL的溶液待用。DMEM培養(yǎng)基和RPMI- 1640購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；小牛血清和胰蛋白酶購(gòu)自杭州四季青生物技術(shù)公司；DMSO（二甲基亞礬）和Con-A購(gòu)自美國(guó)AMRESCO公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

根據(jù)文獻(xiàn)[4], 將細(xì)胞置于含5%CO2，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為DMEM（10%小牛血清，100μ/mL青霉素，100μ/mL鏈霉素），待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后，經(jīng)0.25%胰蛋白酶溶液消化傳代，臺(tái)盼藍(lán)拒染法測(cè)定活細(xì)胞數(shù)，用無(wú)血清培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/mL，制成細(xì)胞懸液備用。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及給藥

根據(jù)文獻(xiàn)[4]，將接種后的小鼠隨機(jī)分為五組，分別為空白組、模型組、順鉑組、黃茂扶正湯組、化療+中藥組。待小鼠成瘤后，腹腔注射順鉑2mg/kg治療[5]，共給藥5次；中藥組每日灌服黃茂扶正湯溶液10mL/（kg?d），共14d；化療+中藥組兩藥用法同前；對(duì)照組給予等量的生理鹽水灌胃。每天密切觀察小鼠體質(zhì)量變化，并記錄腫瘤最長(zhǎng)徑（a）和最短徑（b）。

1.5 標(biāo)本采集

根據(jù)文獻(xiàn)[4]，給藥后第7天，腹腔給藥麻醉小鼠，由尾靜脈取血50μL，并分離眼球血血清。腫瘤標(biāo)本：用眼科剪摘除腫瘤迅速稱重記錄后使用10%的中性甲醛溶液保存。肺標(biāo)本：Boulns液固定小鼠肺24h，經(jīng)無(wú)水乙醇漂洗。計(jì)數(shù)各肺葉表面的Lewis肺癌轉(zhuǎn)移灶數(shù)，計(jì)算肺轉(zhuǎn)移抑制率。骨髓有核細(xì)胞標(biāo)本：來(lái)源于小鼠完整右側(cè)股骨，用白細(xì)胞計(jì)數(shù)板載顯微鏡下計(jì)數(shù)洗液中骨髓有核細(xì)胞數(shù)

1.6 測(cè)定外周血白細(xì)胞數(shù)和骨髓有核細(xì)胞數(shù)

根據(jù)文獻(xiàn)[5]，用白細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù)洗液中骨髓有核細(xì)胞數(shù)或外周血白細(xì)胞數(shù)，按下列公式計(jì)數(shù)/L=4個(gè)大方格內(nèi)白細(xì)胞總數(shù)×10/4×20×106。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSSl3.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±S）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用S-N-Kq檢驗(yàn)法，計(jì)數(shù)資料的比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05認(rèn)為有顯著性差異。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 黃芪扶正湯可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)

各組小鼠在腫瘤細(xì)胞接種后第7天開始，右上肢背部可摸到直徑約3～6mm。與空白對(duì)照組小鼠比較，其中模型對(duì)照組和化療組小鼠出現(xiàn)活動(dòng)及進(jìn)食減少，精神萎靡不振等現(xiàn)象最為明顯，中藥組表現(xiàn)較輕。各組小鼠腫瘤逐日增大，增長(zhǎng)速度最快的為模型對(duì)照組，最慢的為化療+中藥組（圖1，表1）。并且，中藥組瘤重較模型對(duì)照組減輕（P＜0.05）；化療組、中藥組、化療+中藥組的抑瘤率分別是52.0%，387%，68.96%（表2，圖2）。

圖1 各組小鼠的腫瘤生長(zhǎng)曲線

表1 各實(shí)驗(yàn)組小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)的變化（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）

表2 治療后各組Lewis肺癌小鼠瘤重和抑瘤率的比較（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）

2.2 黃芪扶正湯抑制腫瘤肺轉(zhuǎn)移灶的形成

從表3可以看出，相對(duì)于模型對(duì)照組而言，中藥組可減少肺轉(zhuǎn)移灶的形成，中藥加化療組肺轉(zhuǎn)移數(shù)最少。

2.3 黃芪扶正湯促進(jìn)小鼠白細(xì)胞和骨髓有核細(xì)胞增生

圖2 治療后各組Lewis肺癌小鼠瘤重的比較

表3 治療后各組Lewis肺癌小鼠瘤重和抑瘤率的比較（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）

表4 各實(shí)驗(yàn)組對(duì)小鼠白細(xì)胞數(shù)和骨髓有核細(xì)胞數(shù)的影響（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）

如表4所示，相對(duì)于模型對(duì)照組而言，接受順鉑治療組外周血白細(xì)胞和骨髓有核細(xì)胞數(shù)下降（P＜0.05），而同時(shí)接受化療和中藥治療組白細(xì)胞數(shù)和有核細(xì)胞數(shù)均有升高（P＜0.05）。

3 討 論

腫瘤是機(jī)體自身細(xì)胞在各種內(nèi)外致癌因素作用下發(fā)生轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的。腫瘤細(xì)胞在生物學(xué)特征及免疫學(xué)方面與機(jī)體正常細(xì)胞不同，必然導(dǎo)致機(jī)體的免疫應(yīng)答，主要是細(xì)胞免疫。肺癌患者體內(nèi)常呈現(xiàn)免疫功能抑制狀態(tài)[6]，因此肺癌免疫治療獲得了極大的關(guān)注。我國(guó)近年來(lái)在中草藥治療肺癌方面，取得了較大的突破。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)表明[7]，黃芪扶正湯能夠提高小鼠的免疫功能和改善老年人的細(xì)胞及體液免疫功能。目前化療仍然是治療腫瘤的主要手段，但是化療藥物往往會(huì)對(duì)正常組織或細(xì)胞均有不同程度的抑制作用。化療藥物的毒副作用限制了該類藥物在臨床上療效的進(jìn)一步提高。因此臨床上迫切需要利用藥物聯(lián)合應(yīng)用來(lái)提高藥物的療效和降低化療藥物的毒副作用。

研究表明黃芪和黃精均可以通過(guò)增加骨髓造血干細(xì)胞數(shù)目和外周白細(xì)胞數(shù)目來(lái)增加機(jī)體的免疫能力[7-9]，構(gòu)祀也能明顯促進(jìn)小鼠造血功能[10,11]。本中藥復(fù)方成分為黃芪、黃精、構(gòu)祀、女貞子、靈芝五味中藥，雖然每味中藥均能改善機(jī)體的免疫功能，但是復(fù)方是否也能從提高自身免疫能力的角度來(lái)抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及減弱化療藥物的毒副作用呢？本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示中藥組的瘤重減輕（P＜0.05），瘤體積減小、肺轉(zhuǎn)移數(shù)減少 （P＜0.05）。同時(shí)中藥組腫瘤生長(zhǎng)速度減慢。說(shuō)明應(yīng)用黃芪扶正湯對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和肺部轉(zhuǎn)移有一定的抑制作用。并且我們采用了順鉑作為實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照。在實(shí)驗(yàn)中觀察各組小鼠用藥后的基本情況。結(jié)果提示，化療組小鼠出現(xiàn)精神萎靡，活動(dòng)遲緩等現(xiàn)象，中藥組以及中藥組+化療組小鼠情況較好，無(wú)明顯消瘦或聚集現(xiàn)象?？赡茉蚴怯捎诨熕幬锏牟涣挤磻?yīng)導(dǎo)致小鼠進(jìn)食減少，體質(zhì)量增加減少，而聯(lián)合中藥治療后，明顯提高化療效果。說(shuō)明黃芪扶正湯對(duì)化療藥物具有解毒作用，聯(lián)合用藥可以增加化療藥物的療效。結(jié)果同時(shí)提示，應(yīng)用順鉑治療后，小鼠的白細(xì)胞和骨髓有核細(xì)胞被抑制，表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)目下降，但是聯(lián)用黃芪扶正湯后，外周血白細(xì)胞數(shù)和骨髓有核細(xì)胞數(shù)均高于順鉑單獨(dú)使用組，提示該中藥復(fù)方可以減輕化療藥物的毒副作用。但是黃芪扶正湯具體抑制腫瘤的機(jī)制仍然需要進(jìn)一步治療。

[1]周際昌.實(shí)用腫瘤內(nèi)科學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2007:187-198.

[2]Yoshida Y,Nakajima J,Wada H,et al.Gammadelta T-cell immunotherapy for lung cancer[J].Surg Today,2011,41(5):606-611.

[3]Xing J,Li J B,Yu J M,et al.Relationship of dose-volume histogram parameters and computed tomography grading of radiationinduced lung injury in patients with non-small cell lung cancer treated by three-dimensional conformal radiotherapy[J].Zhonghua Zhong Liu Za Zhi,2008,30(9):676-681.

[4]Ioannidis G.,Georgoulias V.,Souglakos J.How close are we to customizing chemotherapy in early non-small cell lung cancer? [J].Ther Adv Med Oncol,2011,3(4):185-205.

[5]Verotta L,Nadia A.El-Sebakhy.Cycloartane and oleanane saponins from Astragalus sp.[J].Stud Nat Products Chemistry,20091,25(Part 5):179-234.

[6]Simon G,Ginsberg RJ,Ruckdeschel JC,et al.Small-cell lung cancer[J].Chest Surg Clin N Am,2001,11(1):165-188.

[7]羅曉麗,楊侃,孫明.黃芪扶正湯對(duì)免疫抑制小鼠的免疫調(diào)節(jié)功能[J].中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2009,34(6):555-558.

[8]姜家康,張自強(qiáng),齊路霞,等.復(fù)方肺積散對(duì)小鼠Lewis肺癌抑制作用及與化療藥聯(lián)合應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào),2009,37(1):33-34.

[9]Shao P,Zhao LH,Chen Z,et al.Regulation on maturation and function of dendritic cells by Astragalus mongholicus polysaccharides[J].Int Immunopharmacol,2006,6(7):1161-1166.

[10]李巖,孫文鵑.黃精粗多糖對(duì)環(huán)磷酰胺所致小鼠白細(xì)胞減少的對(duì)抗作用[J].吉林中醫(yī)藥,1996,(2):38.

[11]Zhu J,Zhao L H,Chen Z,et al.Stimulation by Lycium bararum polysaccharides of the maturation of dendritic cells in murine bone marrow [J].Zhejiang Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban,2006,35(6):648-652.