隋 淼，王曉波，襲榮剛，孫佳丹(.解放軍第0醫(yī)院，國家藥物臨床試驗機構(gòu)，遼寧 大連60;.大連醫(yī)科大學(xué)，遼寧大連605)

司帕沙星是第3代喹諾酮類藥物。其作用機制是抑制細菌DNA合成過程中的DNA旋轉(zhuǎn)酶的作用而起殺菌作用。健康成人空腹單次口服本品0.4 g，服藥后4 h左右達血藥峰濃度(Cmax)，血消除半衰期約16 h左右，口服后主要在小腸吸收，在胃內(nèi)幾乎不吸收。血漿蛋白結(jié)合率為42%～44%。臨床上用于呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、腸道、膽道、皮膚軟組織等感染的治療。目前，司帕沙星的含量測定方法有分光光度法、非水滴定法、高效液相色譜法和流動注射化學(xué)發(fā)光法等。在血藥濃度的研究中，多采用HPLC法。本試驗優(yōu)化了傳統(tǒng)HPLC測司帕沙星片人體的藥代動力學(xué)和生物利用度，采用有機溶劑提取法提高回收率。建立了一種靈敏、準確的高效液相色譜法測定司帕沙星片在人體內(nèi)的代謝過程的方法，為臨床合理用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 試藥與儀器 受試制劑:司帕沙星片，規(guī)格:0.1 g/片，批號:060708，由北京四環(huán)科寶制藥有限公司提供。參比制劑:司帕沙星片(海正立特)，規(guī)格:0.1 g/片，批號:060301，由浙江海正藥業(yè)股份有限公司提供。對照品:司帕沙星標準品，批號:130461-200501，由中國藥品生物制品檢定所提供;內(nèi)標:洛美沙星對照品，批號:0452-200001，由中國藥品生物制品檢定所提供。甲醇、乙腈均為色譜純;二氯甲烷、磷酸氫二鉀、磷酸、磷酸二氫鉀、三乙胺均為分析純;試驗用水為純凈水;空白血漿由大連解放軍第210醫(yī)院提供。

LC-10ATvp高效液相色譜儀，SPD-10Avp紫外檢測器，均為日本島津公司生產(chǎn);N2000色譜數(shù)據(jù)工作臺軟件，浙江大學(xué)智達信息工程有限公司生產(chǎn);TG328A型分析天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn);TGL-16G型臺式離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn);KS康氏振蕩器，江蘇金壇市榮華儀器制造有限公司生產(chǎn);XW-80A微型旋渦混和儀，上海瀘西分析儀器有限公司生產(chǎn);MTN-2800W氮吹濃縮裝置，天津奧特塞恩斯儀器有限公司生產(chǎn)。

1.2 受試者選擇 20例男性健康志愿者，年齡(23.9±1.37)歲，體重(65.9±6.74)kg，身高(175.45±4.52)cm。受試者均通過健康體格檢查，心電圖、心率、血壓、肝腎功能等結(jié)果均為正常;試驗前2周及試驗期間禁服其他任何藥物，并禁煙酒及咖啡類飲料。所有受試者均被告知試驗過程及相關(guān)不良反應(yīng)并簽署知情同意書。

1.3 試驗設(shè)計 本試驗采用隨機分組、雙周期雙交叉試驗的設(shè)計。受試者隨機等分為2組，試驗前禁食10 h，試驗日晨空腹用200 ml溫開水吞服0.4 g試驗制劑或參比制劑。服藥后2 h內(nèi)禁水，給藥4 h和10 h后給予統(tǒng)一低脂肪、低蛋白標準餐。20名受試者服藥2周后交叉給藥，重復(fù)上述試驗。

1.4 血漿樣品收集 受試者于服藥前(0 h)和服藥后 1.0、2.0、3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、8.0、12.0、24.0、48.0、72.0、96.0 h 由前臂靜脈采血 5.0 ml置于肝素管中;離心10 min(3 500 rpm)分離血漿;置-70℃ 冰箱保存待測。

1.5 色譜條件 色譜柱Diamonsil C18(200 mm×4.6 mm，5 μm);柱溫:室溫;流動相:乙腈-磷酸鹽緩沖液(磷酸二氫鉀6.8 g，加適量水溶解，加入三乙胺 3 ml，再加水稀釋至 1 000 ml，搖勻)(20∶80，V/V)，用磷酸調(diào)pH值至2.5±0.1;流速:1.2 ml/min;進樣量:20 μl;檢測波長:298 nm。

1.6 內(nèi)標溶液的配制 精密稱取洛美沙星對照品10 mg，置于100 ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配成濃度為100 μg/ml的洛美沙星儲存液;取取儲備液10 ml置于100 ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，獲得濃度為10 μg/ml的洛美沙星內(nèi)標液，置4℃ 冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 血漿樣品的處理 精密量取空白血漿500 μl，分別精密加入內(nèi)標溶液(10 μg/ml洛美沙星溶液)25 μl、1 mol/L 磷酸氫二鉀溶液 100 μl，漩渦混合 30 s，加入二氯甲烷3 ml，震蕩混合5 min，取有機層置另一離心管中，于40℃ 水浴中空氣吹干，殘留物用流動相150 μl復(fù)溶。復(fù)溶后將樣品轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管中，離心(1 000 r/min)5 min，取上清20 μl進樣分析。

1.8 標準曲線制備 精密量取空白血漿500 μl，加司帕沙星標準系列溶液50 μl，配制成相當于司帕沙星 血漿濃度為20、50、100、250、500、1 000、1 500、2 000 ng/ml的標準溶液，按“血漿樣品處理”同法操作，每一濃度進行雙樣本分析，以待測物濃度為橫坐標，待測物與內(nèi)標物的峰面積比值為縱坐標，用加權(quán)最小二乘法［3］進行回歸運算，求得的直線回歸方程即為標準曲線，Y=0.002 73X-0.008 43，r=0.992 2。由試驗結(jié)果可知司帕沙星血漿濃度測定的線性范圍為20～2 000 ng/ml，血漿中司帕沙星定量下限是20 ng/ml，結(jié)果表明，司帕沙星在測定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.9 色譜行為 上述色譜條件下測得的標準品、服藥前空白血漿和受試者樣品的色譜圖見圖1。司帕沙星、內(nèi)標的保留時間分別為12、6 min。結(jié)果表明，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾司帕沙星和內(nèi)標的測定。

圖1 司帕沙星HPLC色譜圖

1.10 精密度與回收率 取空白離心管分別加入不同濃度的司帕沙星標準溶液50 μl，再加入空白血漿 500 μl，配制成低、中、高(50、500、1 500 ng/ml)3個濃度的血漿樣品，按“血漿樣品處理方法”項下方法試驗，在不同天的時間內(nèi)連續(xù)制備并測定3個分析批，每批樣品分為低、中、高3個濃度水平，每個濃度進行6樣本分析。計算日內(nèi)和日間精密度，數(shù)據(jù)見表1。

表1 司帕沙星精密度與回收率試驗結(jié)果

1.11 回收率 取空白血漿500 μl，制備低、中、高(50、500、1 500 ng/ml)3個濃度的血漿樣品，每一濃度進行6樣本分析。同時另取空白血漿500 μl，除不加標準系列溶液和內(nèi)標外，按“血漿樣品處理方法”項下操作，向獲得的上清液中加入相應(yīng)濃度的標準溶液50 μl和內(nèi)標溶液 25 μl，渦流混合，取樣20 μl分析，獲得相應(yīng)峰面積(3次測定的平均值)。以每一濃度兩種處理方法的峰面積比值計算回收率，數(shù)據(jù)見表1。

1.12 穩(wěn)定性 取空白血漿500 μl分別加入不同濃度司帕沙星標準溶液50 μl，配制成血漿中藥物濃度分別為50、500、1 500 ng/ml的血漿樣品若干份，一份按“血漿樣品處理方法”項下同法試驗，在室溫放置24 h后進樣分析，考察預(yù)處理后血漿樣品在室溫條件下的穩(wěn)定性;一份加入標準溶液在室溫放置24 h后，按“血漿樣品處理方法”項下操作，進樣分析，考察血漿樣品在室溫條件下的穩(wěn)定性;另一份于-20℃冰箱冷凍，反復(fù)凍融3次后，按“血漿樣品處理方法”項下操作，進樣分析，考察血漿樣品經(jīng)3次反復(fù)凍融穩(wěn)定性;一份于-20℃ 冷凍保存13、30 d后，按“血漿樣品處理方法”項下操作，進樣分析，考察血漿樣品在長期冷凍條件下的穩(wěn)定性。結(jié)果血漿中司帕沙星-20℃ 保存條件下濃度無明顯變化(RSD均小于15%)。

2 結(jié)果

2.1 血藥濃度-時間曲線 20名健康受試者口服司帕沙星片試驗制劑和參比制劑0.4 g后平均血藥濃度-時間曲線見圖2。

圖2 20名健康受試者口服司帕沙星片后平均血藥濃度-時間曲線圖

2.2 藥動學(xué)參數(shù) 司帕沙星試驗制劑與參比制劑在人體中的藥動學(xué)參數(shù)見表2。

表2 兩制劑動力學(xué)參數(shù)(n=20，±s)

表2 兩制劑動力學(xué)參數(shù)(n=20，±s)

參數(shù) 試驗制劑 參比制劑tmax(h)4.68±0.44 4.55±0.51 Cmax(ng/ml) 1 560.4±243.9 1584.1±273.9 AUC0-t(ng/ml·h) 43 325±12 174 44 139±11 815 AUC0-∞(ng/ml·h) 45 452±12 884 45 999±12 629 t1/2(h)20.92±4.85 19.81±3.75

2.3 生物等效性檢驗 經(jīng)主要藥動學(xué)參數(shù)對數(shù)轉(zhuǎn)換后進行方差分析，并進一步采用雙單側(cè)t檢驗和(1-2α)置信區(qū)間法進行生物等效性評價，其中tmax采用非參數(shù)檢驗法。結(jié)果表明:司帕沙星片的AUC0-t和Cmax均拒絕生物不等效假設(shè)。受試制劑中，司帕沙星片的AUC0-t的90% 置信區(qū)間為參比制劑的95.5% ～100%，AUC0-∞的90%置信區(qū)間為參比制劑的95.6% ～101.5% ，Cmax的90%置信區(qū)間為參比制劑的95.3% ～102.4%，tmax無統(tǒng)計學(xué)意義。根據(jù)以上結(jié)果，判定兩制劑具有生物等效性。

3 討論

本試驗參照司帕沙星質(zhì)量標準［2］中所用流動相:甲醇-磷酸鹽溶液(磷酸二氫鉀6.8 g，三乙胺3 ml，加水溶解并稀釋至 1 000 ml，搖勻)(57∶43，V/V)用磷酸調(diào)pH值至2.5進行試驗，結(jié)果主成分出峰時間短，內(nèi)源性物質(zhì)峰干擾主成分測定;之后選用分離度效果好的乙腈代替甲醇，重新調(diào)整流動相:乙腈-磷酸鹽溶液(磷酸二氫鉀6.8 g，三乙胺3 ml，加水溶解并稀釋至1 000 ml，搖勻)(20∶80，V/V)用磷酸調(diào)pH至2.5時，內(nèi)標和待測物色譜峰保留時間理想，內(nèi)源性物質(zhì)峰不干擾測定峰。本次試驗中使用的流動相為:乙腈-磷酸鹽溶液(磷酸二氫鉀6.8g，三乙胺3ml，加水溶解并稀釋至1 000 ml，搖勻)(20∶80，V/V)，用磷酸調(diào) pH 值至2.5±0.1。

在提取方法篩選過程中，曾選用沉淀法(以甲醇為沉淀劑)進行提取，結(jié)果血漿中內(nèi)源性物質(zhì)無干擾，回收率較低。之后選用有機溶劑提取法，分別使用氯仿-異丙醇(4∶1，V/V)、氯仿-異丙醇(9∶1，V/V)和二氯甲烷作為提取溶劑，經(jīng)試驗選用二氯甲烷作為提取溶劑，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測定，且提取回收率較高，故最終采用二氯甲烷作為提取溶劑。

［1］中國藥典2005版.二部［S］.2005，附錄173.

［2］中國藥典2005版.二部［S］.2005，161.

［3］鐘大放.以加權(quán)最小二乘法建立生物分析標準曲線的若干問題［J］.藥物分析雜志，2006，16(5):343.

［4］梁 竹，潘菡清，袁 成，等.高效液相色譜法測定血清和尿中司帕沙星的藥物濃度［J］.解放軍藥學(xué)學(xué)報，2005，15(3):40.

［5］張畢奎，楊 宇，李煥德，等.國產(chǎn)司帕沙星片在老年人體內(nèi)的藥動學(xué)研究［J］.臨床藥學(xué)，2008，37(2):120.