任曉慧，陳 新，劉 嘉，鄭燦輝，任雪琴，吳 兵，王如鋒，周有駿(.武漢工業(yè)學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢43003;.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海00433)

近年來，深部真菌感染日趨嚴重，其發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢，嚴重威脅人類的健康和生命。氮唑類化合物是目前臨床上應(yīng)用最廣泛的抗真菌藥物［1］，如氟康唑、伊曲康唑等為臨床治療真菌感染的首選藥。然而現(xiàn)有氮唑類抗真菌藥物存在嚴重的耐藥性和肝腎毒性等［2］問題，使該類藥物的臨床治療受到限制。因此，臨床上迫切需要開發(fā)低毒、高效、廣譜的抗深部真菌感染藥物。

氮唑類抗真菌藥物按結(jié)構(gòu)主要分為三唑醇類和三唑二氧戊環(huán)類。本文根據(jù)氮唑類藥物的構(gòu)效關(guān)系［3，4］，設(shè)計合成了一類新型的三唑二氧戊環(huán)類化合物:2-取代苯乙烯基-4-(2，4-二氟苯基)-4-(1H-1，2，4-三唑-1-基)甲基-1，3-二氧戊環(huán)類化合物的幾何異構(gòu)體6Ka和6Kb。經(jīng)1H NMR、MS確證結(jié)構(gòu)，采用X-射線單晶衍射確證其立體構(gòu)型。并考察不同的立體異構(gòu)體6Ka和6Kb對5種常見致病菌的體外抗真菌活性?；衔?Ka和6Kb的合成路線如下:

以間二氟苯為起始原料，經(jīng)Friedel-Crafts反應(yīng)、與三氮唑縮合、環(huán)氧化，得到中間體1-［2-(2，4-二氟苯基)-2，3-環(huán)氧丙基］-1H-1，2，4-三唑甲磺酸鹽，將環(huán)氧化物甲烷磺酸鹽酸性水解得到2-(2，4-二氟苯基)-3-(1H-1，2，4-三唑-1-基)-1，2-丙二醇，然后與反式對氟肉桂醛縮合脫水得到化合物6Ka和6Kb，見圖1。

圖1 目標化合物的合成路線

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑 Bruker APEX-II CCD型X-射線單晶衍射儀;核磁共振氫譜用Bruker AC-300P型儀器測定，TMS為內(nèi)標，CDCl3為溶劑;質(zhì)譜以 Hewlett.Packard 5988型質(zhì)譜儀測定，EI源，70 eV直接進樣;熔點用RK-Z型熔點儀測定，溫度未校正。所用試劑皆為分析純。

1.2 合成部分

1.2.1 1-［2-(2，4-二氟苯基)-2，3-環(huán)氧丙基］-1H-1，2，4-三唑甲磺酸鹽(4)的合成 按參考文獻［5］制備，收率49.7%，mp 131～132℃。

1.2.2 2-(2，4-二氟苯基)-3-(1H-1，2，4-三唑-1-基)-1，2-丙二醇(5)的合成 按參考文獻［6］制備，收率87%，mp 128～129℃。

1.2.3 (E)-2-(4-氟苯乙烯基)-4-(2，4-二氟苯基)-4-(1H-1，2，4-三唑-1-基)甲基-1，3-二氧戊環(huán)(6Ka和6Kb)的合成 取1.53 g(6.0 mmol)化合物5加入3 ml無水DMF溶解，加入6.0 mmol對氟肉桂醛、少量對甲苯磺酸一水合物和100 ml經(jīng)分子篩干燥過的甲苯，135℃加熱回流攪拌24 h并不斷除去反應(yīng)中產(chǎn)生的水，反應(yīng)完蒸除溶劑，殘留物加入150 ml乙酸乙酯，分別用50 ml水、50 ml飽和食鹽水洗3次，無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液濃縮，殘留物用柱層析分離，以乙酸乙酯-石油醚為洗脫劑，先洗脫下來的為6Ka，后洗脫下來的為6Kb。6Ka和6Kb用正己烷和乙酸乙酯結(jié)晶，得到晶體6Ka和6Kb。6Ka為白色固體，收率36.2% ～54.3%，6Kb為淡黃色固體，收率15.5% ～29.3%。6Ka和6Kb的熔點、MS和1HNMR數(shù)據(jù)見表1。

2 6Ka和6Kb晶體結(jié)構(gòu)測定與結(jié)果

將6Ka(0.25 mm×0.20 mm×0.12 mm)或6Kb(0.12 mm ×0.08 mm ×0.04 mm)單晶置于衍射儀上，采用石墨單色化的CuKα射線(λ=1.541 78 ?)以φ-ω掃描方式在296(2)K收集衍射數(shù)據(jù)。其中6Ka在4.20°≤θ≤64.98 °(h:-9 ～9，k:-9 ～11，l:-24～24)收集9 914個強反射數(shù)據(jù)，其中獨立衍射點3 001個［Rint=0.060 1］;6Kb在3.90°≤θ≤5 9.99°(h:-15 ～15，k:-8 ～8，l:-20 ～20)收集6 626個強反射數(shù)據(jù)，其中獨立衍射點2 451個［Rint=0.359 5］。強度數(shù)據(jù)進行了經(jīng)驗吸收校正和LP校正。6Ka和6Kb的晶體結(jié)構(gòu)解析采用直接法，結(jié)構(gòu)解析和計算使用SHELXS-97和SHELXL-97程序完成，氫原子坐標經(jīng)差值 Fourier合成得到，非氫原子坐標由直接法得到。氫原子采用各向同性熱參數(shù)修正，其它原子采用各向異性熱參數(shù)修正。晶體結(jié)構(gòu)用全矩陣最小二乘法修正。

表1 6Ka和6Kb的熔點、質(zhì)譜及核磁數(shù)據(jù)

分子結(jié)構(gòu)解析表明，6 Ka的組成為C20H16F3N3O2，分子量為 387.36，屬單斜晶系，P2(1)/c空間群，晶體參數(shù) a=8.360 4(3)?，b=10.162 4(3)?，c=21.080 1(6)?，α =90°，β=91.495(2)°，γ =90°，V=1 790.39(10)?3，Z=4，Dc=1.437 g/cm3，μ =0.990 mm-1，F(xiàn)(000)=800，最終偏離因子 R=0.052 1，wR=0.155 2。6Kb的組成為C20H16F3N3O2，分子量為387.36，屬單斜晶系，P2(1)/n空間群，晶體參數(shù)a=13.383(5)?，b=7.448(3)?，c=18.559(8)?，α =90°，β =95.393(19)°，γ =90°，V=1 841.8(13)?3，Z=4，Dc=1.397 g/cm3，μ =0.962 mm-1，F(xiàn)(000)=800，最終偏離因子 R=0.123 8，wR=0.341 5。根據(jù)［7～9］三氮唑環(huán)與 4-氟苯乙烯基在1，3-二氧戊環(huán)同側(cè)的為順式構(gòu)型，在異側(cè)的為反式構(gòu)型，我們得出6Ka為順式-2R，4R和順式-2S，4S的外消旋體，而6Kb為反式-2S，4R和反式-2R，4S的外消旋體。

6Ka和6Kb的分子結(jié)構(gòu)見圖2，主要晶體學(xué)數(shù)據(jù)列于表2。

圖2 6Ka和6Kb的分子結(jié)構(gòu)圖

表2 6Ka和6Kb的部分晶體學(xué)參數(shù)

3 抗真菌活性實驗

3.1 對照藥物與受試菌株 對照藥物:氟康唑(FCZ，輝瑞制藥有限公司)、伊曲康唑(ICZ，Sigma公司)、兩性霉素B(AMB)。

受試菌株:白假絲酵母菌(Candida albicans，C.alb)、熱帶假絲酵母菌(Candida tropicalis，C.tro)、近平滑假絲酵母菌(Candida parapsilosis，C.par)、新生隱球菌(Cryptococcus neoformans，C.neo)均由第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院新藥研究中心真菌菌種庫提供。

3.2 6Ka和6Kb的體外抗真菌活性測試 采用美國臨床實驗室標準化協(xié)會［10，11］文件所推薦的微量液基稀釋法檢測待篩選化合物的體外抗真菌活性，以目標化合物抑制所選真菌80%生長率的濃度作為判斷終點 (MIC80)。當藥物MIC80值超過測定濃度范圍時，按以下方法進行統(tǒng)計:MIC80值高于最高濃度64 μg/ml時計為“64 μg/ml”;MIC80值為最低濃度或以下時，不作區(qū)別均計為“≤0.000 24 μg/ml”，結(jié)果見表 3。

體外抗真菌活性表明，化合物6Kb對5種致病菌的活性均高于化合物6 Ka。6 Ka和6 Kb對白假絲酵母菌Y0109和SC5314及熱帶假絲酵母菌的抑制作用均高于對照藥伊曲康唑、兩性霉素B和氟康唑。其中6 Kb對白假絲酵母菌Y0109和SC5314及熱帶假絲酵母菌的活性是伊曲康唑的16倍。6 Kb對近平滑假絲酵母菌的活性高于對照藥或與對照藥相當。6 Ka和6 Kb對新生隱球菌的活性高于氟康唑和兩性霉素B。

表3 6Ka和6Kb的體外抗真菌活性(MIC80，μg/ml)

4 結(jié)論

合成了(E)1-［4-(2，4-二氟苯基)-2-［2-(4-氟苯基)-乙烯基］-［1，3］二氧戊環(huán)-4-甲基］-1H-［1，2，4］三氮唑化合物的幾何異構(gòu)體6 Ka和6 Kb，測定其晶體結(jié)構(gòu)，并考察了其體外抗真菌活性。結(jié)果表明，6 Ka和6 Kb對于5種測試真菌均具有很強的抑菌活性，且該類化合物的反式構(gòu)型的抗真菌活性優(yōu)于其順式構(gòu)型。研究結(jié)果為深入開展該類抗真菌化合物的設(shè)計研究打下扎實的基礎(chǔ)。

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