花蕾 程婷婷

2011年南京市外環(huán)境水體及水產(chǎn)品致病性弧菌污染狀況分析

花蕾①程婷婷①

目的：了解南京市外環(huán)境水體與水產(chǎn)品中致病性弧菌污染狀況，預防和控制此類食物中毒的發(fā)生。方法：采集外環(huán)境水體與水產(chǎn)品，用堿性蛋白胨水增菌、慶大瓊脂、TCBS瓊脂、科瑪嘉弧菌顯色瓊脂分離，對分離出的致病性弧菌進行系統(tǒng)生化鑒定，對分離出的霍亂弧菌用血清學和多重熒光PCR方法進行分型與毒力檢測。結果：2011年共采集南京市外環(huán)境水體與水產(chǎn)品共151份，其中檢出致病性弧菌8種，共38株，檢出率依次為霍亂弧菌7.28%、副溶血弧菌5.83%、嗜水氣單胞菌4.64%、溶澡弧菌3.33%、溫和氣單胞菌3.31%、創(chuàng)傷弧菌1.67%、梅氏弧菌0.83%、類志賀鄰單胞菌0.83%。其中分離出的霍亂弧菌均為非01/非0139群霍亂弧菌且不攜帶霍亂腸毒素。結論：2011年水產(chǎn)品中非01/非0139群霍亂弧菌污染較為嚴重，其次為副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌等；外環(huán)境水體中嗜水氣單胞菌污染較為嚴重，需加強外環(huán)境水體與水產(chǎn)品的監(jiān)測，做好預防控制疾病工作。

致病性弧菌； 外環(huán)境水體； 水產(chǎn)品； 霍亂腸毒素

致病性弧菌廣泛分布于海水、淡水、海產(chǎn)品中，人類攝入或接觸污染的水源和食物易引起感染。近年來，有關致病性弧菌引起衛(wèi)生健康事件時有報道[1-3]。為了解南京市外環(huán)境水體及水產(chǎn)品中致病性弧菌的污染狀況，采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法進行分離培養(yǎng)鑒定，并進行毒力檢測，為及時發(fā)現(xiàn)、及時預測疫情和制定防治策略提供依據(jù)?，F(xiàn)將南京市疾控中心2011年對151份外環(huán)境水體及水產(chǎn)品監(jiān)測情況報告如下。

1 材料與方法

1.1 標本采集與種類

1.1.1 外環(huán)境水體 取自南京市中山陵燕雀湖，每個取樣點分成相隔數(shù)米的位置，分別用滅菌采樣瓶采集，共31份。

1.1.2 水產(chǎn)品 取自南京市下關區(qū)惠明橋水產(chǎn)品批發(fā)市場，共120份。

1.2 試劑與儀器 法國梅里埃ATB生化鑒定儀、ABI 7500 Fast型實時熒光定量PCR儀?；【片敿物@色培養(yǎng)基及ID32E生化試劑條均購自法國梅里埃公司。堿性蛋白胨水、TCBS選擇性瓊脂、慶大選擇性瓊脂由環(huán)凱公司生產(chǎn)?；魜y弧菌DNA多重熒光PCR試劑盒購自廈門百維信生物科技有限公司。霍亂弧菌診斷血清購自寧波天潤生物藥業(yè)有限公司。均為有效期內(nèi)使用。

1.3 檢測方法 霍亂弧菌依據(jù)《霍亂防治手冊》，其他弧菌依據(jù)《全國臨床檢驗操作規(guī)程》進行檢測。樣本接種堿性蛋白胨水培養(yǎng)37 ℃ 8 h，取菌膜下表層培養(yǎng)物再次接種堿性蛋白胨水二次增菌培養(yǎng)37 ℃ 8 h，取二次增菌液培養(yǎng)物轉種慶大選擇性瓊脂、TCBS選擇性瓊脂、弧菌科瑪嘉顯色瓊脂培養(yǎng)37 ℃ 24 h，挑取可疑菌落轉種雙糖鐵瓊脂、營養(yǎng)瓊脂，純化的菌種進行生化及血清學檢測，生化結果符合霍亂弧菌的菌株用四重熒光PCR方法進行分型與霍亂腸毒素檢測。

2 結果

2.1 外環(huán)境水體、水產(chǎn)品致病菌檢測情況 2011年采集南京市外環(huán)境水體、水產(chǎn)品樣本共151份，檢出致病性弧菌8種，共38株。外環(huán)境水體中檢出3種致病性弧菌，分別為嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌和非01/非0139群霍亂弧菌，其中嗜水氣單胞菌檢出率最高，達16.2%；水產(chǎn)品中非01/非0139群霍亂弧菌檢出率最高，達8.33%，其次為副溶血弧菌、溶藻弧菌等7種其他致病性弧菌。見表1。

2.2 血清學方法檢測霍亂弧菌 對分離出的11株霍亂弧菌經(jīng)血清凝集試驗均為自凝菌，無法分型。

表1 外環(huán)境水體、水產(chǎn)品致瀉性弧菌檢測情況

2.3 多重熒光PCR方法對霍亂弧菌分型和毒力檢測 對分離出的11株霍亂弧菌進行四重熒光PCR檢測，分別針對霍亂弧菌hlyA基因、霍亂01菌群特異性基因01rfb、霍亂0139菌群特異性基因0139rfb和霍亂產(chǎn)毒基因ctxA，結果均為霍亂弧菌hlyA基因陽性、其他三種基因陰性，故均判定為非01/非0139群霍亂弧菌，不攜帶霍亂腸毒素。

3 討論

2011年對31份外環(huán)境水體檢測結果顯示，嗜水氣單胞菌為主要污染菌，檢出率達16.2%，其次為溫和氣單胞菌檢出率為6.45%。人類感染氣單胞菌主要以腸道感染為主，所感染的氣單胞菌以嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌和豚鼠氣單胞菌為主[4]。氣單胞菌可產(chǎn)生腸毒素、溶血素、細胞毒素等，均有較強的致病性，免疫功能低下或合并慢性疾病患者易感染，且可發(fā)生腸道外感染，如心內(nèi)膜炎、咽炎、肺炎、膽囊炎等，甚至出現(xiàn)敗血癥、感染性休克和肺水腫等嚴重并發(fā)癥[5]。目前，國外已將嗜水氣單胞菌納入腹瀉病原菌的檢測范圍，是食品衛(wèi)生檢測的對象，下一步本實驗室還將對所分離的菌株做進一步毒力基因測定和耐藥性試驗。

2011年對120份水產(chǎn)品檢測，非01/非0139群霍亂弧菌檢出率為8.33%，在所有檢出的致病性弧菌中排列首位。近年來國內(nèi)外關于非01群霍亂弧菌致病的報告逐漸增多，在國內(nèi)非01/非0139群霍亂弧菌是引起夏、秋季腹瀉和食源性疾病的主要病原菌，據(jù)報道其發(fā)病率有超過沙門菌、志賀菌[6]?；魜y弧菌致病關鍵因素是霍亂腸毒素（CT）和毒素共調菌毛（TCP）?；魜y毒素基因ctxAB并非為霍亂弧菌所固有，而是由霍亂弧菌染色體上的一種溶原性噬菌體基因組所攜帶，該單元可被誘導為形成新的子代噬菌體，整合入受體菌染色體上特異位點，會導致毒素基因在產(chǎn)毒株和非產(chǎn)毒的非致病性菌株間的水平轉移。CT是由ctxAB基因編碼；TCP作為定植因子，由tcp基因編碼。研究表明，霍亂弧菌存在ctxA+tcpA+、ctxA-tcpA+、ctxA-tcpA-的致病相關基因模式，提示tcp是獲得CTX因子的前提，tcp的表達對于CTX因子在有毒株和無毒株問的轉移至關重要[7]。提示缺少CT的菌株可能通過與產(chǎn)毒性01、0139霍亂弧菌不同的機制引起人體腹瀉。當菌株缺失部分或全部CTX毒力因子上的基因時，可能產(chǎn)生其他毒素，如NAG-特異性熱穩(wěn)定毒素、熱穩(wěn)定直接溶血素、志賀樣毒素等，它們在致腹瀉的機制中可能起到某種促進的作用。此次分離出的非01/非0139群霍亂弧菌經(jīng)檢測均不攜帶霍亂腸毒素，但未檢測tcp及其他毒素，不排除有獲得霍亂腸毒素及攜帶其他毒素的可能，需進一步檢測，并引起有關部門的高度重視，及時制訂有效的、針對性強的預防控制措施。

本次檢測從水產(chǎn)品中還檢出副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌等其他致病性弧菌。其中副溶血弧菌7株，分離自花螺、龍蝦和扇貝，分離率僅次于非01/非0139群霍亂弧菌。副溶血弧菌是引起食源性疾病的重要病原之一，可導致患者腹瀉、腸痙攣、惡心、嘔吐、發(fā)燒等典型胃腸炎反應。創(chuàng)傷弧菌檢出2株，分離自海螺和章魚。創(chuàng)傷弧菌能夠引起胃腸炎、傷口感染和原發(fā)性敗血癥，通常人類感染是因為食用生或半生的受污染海產(chǎn)品。創(chuàng)傷弧菌是美國海產(chǎn)品消費引起死亡的首要原因，美國州際貝類衛(wèi)生委員會（ISSC）規(guī)定，收獲后經(jīng)處理的牡蠣中創(chuàng)傷弧菌限量不超過30 CFU/g[8]。由于人們飲食習慣的改變，對于海產(chǎn)品等的食用量增加，生吃水產(chǎn)品的品種越來越多，人群暴露的機會和規(guī)模都呈上升的趨勢，造成食物中毒的潛在危險，致瀉性弧菌成為感染性腹瀉的主要致病菌。同時，食品加工存在生熟不分、加熱不透現(xiàn)象，飲食衛(wèi)生環(huán)節(jié)存在薄弱環(huán)節(jié)，因此，必須進一步加強對外環(huán)境，尤其是水產(chǎn)品的監(jiān)測，掌握病原菌分布特點，研究其與人群發(fā)病的關系，以便及時采取措施降低危害。依據(jù)此次監(jiān)測結果顯示，生食水產(chǎn)品極易引起食物中毒，因此，相關部門要積極采取措施，加強宣傳，教育市民食用水產(chǎn)品一定要煮熟、煮透，盡量避免生食、半生食，又做到刀板、食具、容器生熟分開，操作過程中防止交叉污染，并防止由此引起的食物中毒。

[1] 邱波，王本利.一起食物中毒分離出溶藻弧菌的病原學研究[J].職業(yè)與健康，2004，20（11）：65-66.

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Analysis on Polluting Situation of Causative Vibrio in External Environmental Water and Sea Products in Nanjing Area from 2011

HUA Lei，CHENG Ting-ting.

Objective:To understand contamination status of external environmental water and sea products in Nanjing，prevention and treatment of food poisoning.Method:External environmental water and sea products samples were collected，samples were proliferated in alkaline liquid mediam，and purified in Gentamycin Agar， Thiosulfate-Citrate-Bile-Sucrose agar and chromager vibrio colored agar，The virulence gene and phenotype of the isolated strains were detected by coagulation with diagnostic serum and multi-fluorescent PCR.Result：2011 In Nanjing，collection a total of 151 environmental water and sea products，with 38 strains of eight kinds of causative vibrio isolated， the rates of isolation of V.chelera，V.parahaemolyticus，Aeromonas hydrophila，V.alginalyticus，Aeromonas mild，V.vulnicus， V.metschnikovi，Plesiomonas shigelloides were 7.28%，5.83%，4.64%，3.33%，3.31%，1.67%，0.83% and 0.83%，respecvtively.The vibrio cholera were Non-01 Non-0139 vibrio cholera and not carry cholera toxin.Conclusion：In 2011，sea products from Non-01 Non-0139 vibrio cholera polluted more serious，Secondly，Vibrio parahaemolyticus、Vibrio vulnificus etc，in external water， aeromonas hydrophila relatively serious， must to strengthen the monitoring and disease prevention of environmental water and aquatic products.

Causative vibrio； External environmental water； Sea products； Choler toxin

The Center for Disease Control and Prevention of Nanjing, Nanjing 210003, China

/Medical Innovation of China，2012，9（34）:003-005

10.3969/j.issn.1674-4985.2012.34.002

①南京市疾病預防控制中心 江蘇 南京 210003通訊作者：花蕾

2012-09-03） （本文編輯：連勝利）