范勇洪

(平頂山市第一人民醫(yī)院泌尿外科 河南 平頂山 467000)

目前研究認(rèn)為ICCs可能是膀胱慢波活動(dòng)的起搏器和傳導(dǎo)者。去除了神經(jīng)和體液等干擾因素后離體膀胱平滑肌條,仍可以發(fā)生自發(fā)性興奮和收縮[1]。因此推測(cè):DCP發(fā)病是否與膀胱ICCs樣細(xì)胞的改變有關(guān)。離體的ICCs細(xì)胞在高糖環(huán)境下變化尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)體外培養(yǎng)、熒光負(fù)載的方法來(lái)觀察高糖環(huán)境對(duì)ICCs細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,以探討DCP功能改變的細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

12只健康豚鼠。激光共聚焦顯微鏡META 510,膠原酶V(Sigma公司),Fluo－4 AM,葡萄糖,標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清。

1.2 方法

1.2.1 豚鼠膀胱ICCs細(xì)胞的體外培養(yǎng) 脫臼處死豚鼠,無(wú)菌手術(shù)取出其膀胱,取肌層并剪成碎塊,膠原酶V消化后,制成無(wú)糖DMEM細(xì)胞懸液,接種于培養(yǎng)皿中,37℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24h,棄去皿中培養(yǎng)液,分別加入含5、10、15mmol/L葡萄糖的高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液,分別培養(yǎng)24、72h。

1.2.2 激光共聚焦顯微鏡觀察 Fluo－4AM工作液加入培養(yǎng)好ICCs細(xì)胞培養(yǎng)皿中,入培養(yǎng)箱內(nèi)孵育40min,除去細(xì)胞外熒光染料,室溫下避光靜置10min。染色好Cajal間質(zhì)細(xì)胞置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。每個(gè)樣本隨機(jī)選60個(gè)ICCs細(xì)胞,掃描記錄成象。用META自帶分析軟件測(cè)量細(xì)胞長(zhǎng)度,獲得熒光背景下每個(gè)細(xì)胞長(zhǎng)度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 ICCs細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

膠原酶消化后的細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),倒置顯微鏡下可見(jiàn)典型的ICCs細(xì)胞,形態(tài)基本一致,以胞體為中心的向相反方向延伸的兩個(gè)長(zhǎng)突起,可有分枝(圖1)。

2.2 免疫熒光染色

ICCs細(xì)胞Fluo－4AM熒光染色,共聚焦顯微鏡下400倍視野可見(jiàn)不同葡萄糖濃度、不同培養(yǎng)時(shí)間段的ICCs細(xì)胞,隨葡萄糖濃度的增加和培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),ICCs細(xì)胞明顯出現(xiàn)胞體縮小的現(xiàn)象(圖2)。

2.3 ICCs細(xì)胞形態(tài)結(jié)果

參照McClosky[2]的方法,激光共聚焦掃描記錄ICCs細(xì)胞圖片,用META自帶分析軟件測(cè)量細(xì)胞長(zhǎng)度值,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間比較:24h組和72h組對(duì)比,隨葡萄糖濃度增高,ICC細(xì)胞長(zhǎng)度明顯縮短(P<0.01)。組內(nèi)比較:5mmol/L組細(xì)胞長(zhǎng)度無(wú)差異(P>0.05)。10mmol/L組隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞長(zhǎng)度增長(zhǎng)(P<0.01)。15mmol/L組隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞長(zhǎng)度縮短(P<0.01)。

圖1 倒置顯微鏡下ICC樣細(xì)胞(×40)

圖2－A ICC樣細(xì)胞5mol/24h(×400)

圖2－B ICC樣細(xì)胞15mol/72h(×400)

表1 不同濃度不同時(shí)間段細(xì)胞長(zhǎng)度值比較[(單位μm),()]

表1 不同濃度不同時(shí)間段細(xì)胞長(zhǎng)度值比較[(單位μm),()]

注:▲▲P<0.01同一濃度間比較;★★P<0.01同一時(shí)間間比較

分組 5m m ol 10m m ol 15m m ol 24h 84.63±21.80 (73.71±15.23)▲▲ (67.30±1386)▲▲72h 80.88±20.81 (85.80±18.29)▲▲★★ (58.65±21.49)▲▲★★

3 討論

糖尿病造成多系統(tǒng)病變。DCP是其最常見(jiàn)癥狀。該病病因復(fù)雜,研究發(fā)現(xiàn)DCP存在逼尿肌肌細(xì)胞[3]病變、神經(jīng)退化,突觸和神經(jīng)遞質(zhì)改變、多種因子、受體分布和含量異常[4]等,但仍無(wú)法合理解釋DCP的發(fā)病機(jī)制。眾多研究結(jié)果顯示ICCs是膀胱慢波活動(dòng)的起搏器和傳導(dǎo)者,為我們研究DCP發(fā)病機(jī)制提供了新的思路?；铙w內(nèi)高糖對(duì)豚鼠膀胱ICCs的數(shù)量、形態(tài)及其超微結(jié)構(gòu)有影響我們前期已經(jīng)證實(shí),但離體的豚鼠膀胱ICCs在單因素高糖環(huán)境中的改變目前尚未見(jiàn)報(bào)導(dǎo)。

本研研究通過(guò)對(duì)離體的豚鼠ICCs細(xì)胞培養(yǎng),觀察高糖環(huán)境下ICCs細(xì)胞形態(tài)的變化。結(jié)果顯示5mmol/L濃度環(huán)境下ICCs細(xì)胞長(zhǎng)度無(wú)明顯差異。當(dāng)葡萄糖濃度升高和培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),ICCs細(xì)胞長(zhǎng)度明顯縮短,只有10mmoL/72h組細(xì)胞長(zhǎng)度增長(zhǎng)。數(shù)據(jù)分析顯示:正常生理濃度的葡萄糖對(duì)ICCs并無(wú)影響。10mol/L組24h細(xì)胞長(zhǎng)度明顯縮短,72h又增長(zhǎng),可能是高糖刺激ICCs短時(shí)間抑制了ICCs的生理功能。隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞功能恢復(fù)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、線粒體腫脹、胞質(zhì)內(nèi)空泡形成等,致使ICCs細(xì)胞體積增大,長(zhǎng)度增長(zhǎng),造成其生理功能異常改變。15mol/L組胞體明顯縮短,并隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)胞體進(jìn)一步變小,可能是過(guò)高濃度的糖對(duì)ICCs直接造成破壞,隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)過(guò)高濃度的糖環(huán)境持續(xù)破壞,線粒體發(fā)生腫脹、空泡樣變甚至溶解,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生脫顆粒,胞質(zhì)廣泛溶解等,導(dǎo)致ICCs細(xì)胞進(jìn)一步縮小縮短致使其結(jié)構(gòu)、功能異常。

本研究結(jié)果提示,高糖環(huán)境與DCP中ICCs功能改變有重要關(guān)系。高濃度長(zhǎng)時(shí)間的影響,致使ICCs內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞,進(jìn)而造成形態(tài)改變,導(dǎo)致其作為起搏功能及控制肌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的結(jié)構(gòu)、功能異常,導(dǎo)致膀胱逼尿肌收縮能力異常,臨床出現(xiàn)DCP癥狀。ICCs形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化可能是DCP發(fā)生的重要病理基礎(chǔ)之一。

[1]Jiang HH,SongB,Lu GS,et al.Loss of ryanodine receptor calcium release channel expression associated with overactive urinary bladder smooth muscle contractions in adetrusor instability model[J].BJU Int,2005,96(3):428～433.

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