李 麗，崔 波

（山東輕工業(yè)學院，山東濟南250353）

微波加熱雙酶協(xié)同水解玉米蛋白粉制備玉米肽

李 麗，崔 波*

（山東輕工業(yè)學院，山東濟南250353）

以玉米蛋白粉為原料，采用微波加熱多酶協(xié)同水解法制備小分子肽。確定了最佳水解工藝。水解后的多肽經(jīng)過Sephadex G-15分離得到兩個組分，分別測定兩個組分對超氧自由基的抑制能力，結果為分子量大于1355u的組分對超氧自由基的清除能力大于分子量小于204u的組分。

玉米蛋白粉，酶解，抗氧化

玉米黃粉是玉米淀粉加工中的副產(chǎn)物，玉米經(jīng)濕磨法工藝制得粗淀粉乳，再經(jīng)蛋白質(zhì)分離得到麩質(zhì)水，然后濃縮干燥即制得玉米黃粉，俗稱黃粉子。玉米黃粉含有豐富的蛋白質(zhì)，其中中性氨基酸和芳香族氨基酸含量較高，是植物蛋白中較有特色的組成[1]。但由于玉米蛋白溶解性差[2]，嚴重限制了其在食品中的應用。玉米肽的開發(fā)使玉米蛋白粉由不溶變?yōu)楦叨瓤扇躘3]。此外，玉米肽具有的抗疲勞[4]、抗氧化[5-6]、促進乙醇代謝[7-8]、降血壓[9-11]、保肝[12]等生理活性，使其極具開發(fā)前景，可以被廣泛地應用于食品及相關領域。但是，目前玉米肽多采用單一酶水解方法制備，肽的產(chǎn)率較低[13]。本文采用雙酶協(xié)同水解法制備玉米肽，產(chǎn)率得到較為明顯的提高。劉振春等[14]利用微波和酶技術相結合，提取玉米蛋白粉中的黃色素。李磊等[15]研究表明，微波加熱可以縮短蛋白酶解時間，提高分解效率，并且得出了微波加熱和復合酶水解是將蛋白分解成多肽的高效方法。近年來超聲在食品工業(yè)中的應用日益廣泛。楊曉泉[16]等的研究表明低頻超聲主要影響大豆的7S蛋白組分，并使其發(fā)生聚合。梁漢華[17]研究表明超聲處理大豆?jié){體及豆渣可有效提高蛋白質(zhì)和固形物的萃取率。Wang[18]的研究表明超聲處理蛋白質(zhì)溶液可明顯提高其親水性和溶解性，其作用包括分解蛋白質(zhì)分子、乳化蛋白質(zhì)懸浮液以及使蛋白質(zhì)發(fā)生聚合等，已有超聲浸提玉米蛋白和大豆分離蛋白文獻報道[19]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米黃粉（蛋白含量78%） 西王集團；中性蛋白酶Neutrase 0.8L（酶活：0.8AU/g），堿性蛋白酶Alcalase 3.0T（酶活：3.0AU/g），ɑ-淀粉酶（酶活：800FAU/g） 諾維信（中國）生物技術有限公司。

Sartorius PB-10精密酸度計 沈陽凱萊儀器銷售有限公司；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司；AL204電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；落地式全溫振蕩器 上海精宏實驗設備有限公司；HHS-2型電熱恒溫水浴鍋 上海衡平儀器儀表廠；單槽式超聲波清洗機 青島冠吉自動化清洗設備有限公司；格蘭仕微波爐（P70D20TJ-D3） 凱爾微波系統(tǒng)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 玉米肽制備的工藝流程 玉米黃粉→超聲波10min→α-淀粉酶（調(diào)pH5.5，50℃反應1h，95℃滅酶15min）→無水亞硫酸鈉5g→加中性蛋白酶→一段酶解（pH7.0，50℃反應5h，95℃滅酶15min）→加堿性蛋白酶→二段酶解（pH8.5，50℃反應5h，95℃滅酶15min）→酶解液→冷凍干燥→玉米肽粗品→SephadexG-15分離純化

1.2.2 測定方法 蛋白含量的測定：凱氏定氮；水解度的計算：本實驗采用簡易法測定蛋白質(zhì)水解度（DH%），公式如下[20]：

式中：B為NaOH的體積（mL）；Mb為NaOH的濃度（mol/L）；Mp為蛋白質(zhì)的質(zhì)量，本實驗中為玉米黃粉的質(zhì)量乘以0.784；htot為每克原料蛋白質(zhì)中肽鍵的mmol數(shù)，本實驗中為9.2；α=10（pH-pK）/[1+10（pH-pK）]。

1.2.3 玉米黃粉的預處理

1.2.3.1 破碎 將玉米黃粉充分破碎后，過80目篩。

1.2.3.2 超聲波處理 在超聲作用下，強烈的攪拌剪切效應使分子內(nèi)的吸引作用受到破壞，分子由卷曲狀態(tài)成為較為伸展的狀態(tài)，增加分子表面的電荷，加強了分子與分子之間、分子與溶劑之間的靜電作用，溶液的流動阻力減小；溶液的粘度減小。由于卷曲的分子較伸展的分子具有更好的彈性，超聲處理使溶液表現(xiàn)出彈性下降，但超聲處理對儲能模量的弱化作用低于對損耗模量的弱化作用[21]。利用超聲波對玉米蛋白進行預處理，可顯著地對玉米蛋白進行破壁，有利于酶發(fā)揮水解作用，提高玉米蛋白的水解度，并且縮短水解時間。

1.2.3.3 脫淀粉 在一般的玉米胚乳中，蛋白體被淀粉顆粒緊緊地包裹著，在掃描電鏡照片上玉米蛋白體和淀粉顆粒呈牙狀交錯。而且在牙狀交錯的外圍，還有一層蛋白質(zhì)介質(zhì)緊緊地包裹住淀粉粒。由于玉米胚乳中蛋白質(zhì)和淀粉存在的特殊形態(tài)，使其在濕法制粉工藝中不能完全分離，得到的副產(chǎn)品玉米蛋白粉（黃粉）中仍含有25%左右的淀粉[5]。因此對玉米蛋白粉進行脫淀粉處理除去其中大部分的淀粉和糖，使得到的玉米蛋白粉中蛋白質(zhì)含量大增，更有利于酶水解反應的進行[5]。

衛(wèi)星傳輸技術主要是將新聞采集現(xiàn)場所收集到的視頻和音頻等內(nèi)容通過衛(wèi)星采集系統(tǒng)的處理，發(fā)射到與信息同步的衛(wèi)星上，再通過衛(wèi)星傳送到電視臺，該種技術所需要的成本較高，并且操作較為復雜。光纖傳播技術主要的信息傳輸介質(zhì)為光導纖維，該種技術有著較強的抗干擾能力，并且在傳輸過程中信息容量較大，但是，這種技術需要鋪設光纖，受到了地理環(huán)境的影響。但是，4k技術的應用就有效解決了這些問題，其較高的靈活性以及高效性受到了電視臺的青睞。

1.2.3.4 玉米黃粉蛋白的增溶 加入還原劑Na2SO3，玉米黃粉蛋白的溶解度增加，并且隨著Na2SO3濃度增加，溶解度和NSI（氮溶指數(shù)）均增加。其主要原因在于，玉米蛋白中存在大量的二硫鍵，這些二硫鍵在蛋白質(zhì)分子內(nèi)和蛋白質(zhì)分子間形成連結，使蛋白質(zhì)分子結構緊湊，加入還原劑能在一定程度上破壞二硫鍵，使蛋白質(zhì)分子結構變得松散，暴露出更多的肽鍵和親水基團，增大了蛋白質(zhì)的溶解性[5]。

1.2.4 分子量分布的測定

1.2.4.1 標準物質(zhì)的選擇和洗脫體積的確定 低聚肽的分子量主要分布在300～700u范圍內(nèi)，為了準確測定低聚肽的分子量分布，選用VB12（MW 1355u）和L-色氨酸（MW 204u）作為標準樣品。根據(jù)測定的洗脫體積確定玉米肽的分子量分布情況。為了準確地確定洗脫體積，實驗中先洗脫VB12和L-色氨酸，找出二者的洗脫體積，并且間隔10mL收集一次洗脫的餾分，而后在波長為361nm的紫外線分光光度計下測定每個餾分的吸光度，經(jīng)測定可以得知VB12在90～100mL時具有最大吸收峰，而L-色氨酸在169mL處有最大吸收峰。結合兩個標準樣經(jīng)過洗脫后出峰的情況，實驗中將94mL之前被洗脫下來的確定為分子量大于1355u的大分子量肽，169mL之后被洗脫下來的確定為游離氨基酸（即MW＜204u），中間被洗脫下來的是分子量為204～1355u之間的低聚肽。

1.2.4.2 Sephadex G-15凝膠預處理及裝柱 稱取Sephadex G-15干粉38g，加入過量的蒸餾水，室溫浸泡24h。而后加入適量pH7.2磷酸-磷酸鹽緩沖溶液，沸水浴中加熱1h。將溶脹好的凝膠冷卻并脫氣30min，此時便可以裝柱。

1.2.4.3 上柱與洗脫 用3～5倍體積的磷酸-磷酸鹽緩沖液平衡層析柱，凝膠柱平衡后即可進行上柱。上柱要在洗脫液液面恰好與凝膠床表面相平時加入樣品液。實驗中使用的核酸蛋白質(zhì)檢測儀的波長是280nm。

1.2.4.4 不同分子量大小的大豆肽含量的計算 將分子量分布曲線上從洗脫開始到洗脫體積為94mL時的峰面積記為S1，從洗脫體積為94mL到169mL時的峰面積記為S2，從洗脫體積為169mL到柱子平衡洗脫結束時的峰面積記為S3。

1.2.5.1 實驗操作 鄰苯三酚自氧化速率的測定取4.5mL 50mmol/L Tris-HCl緩沖溶液（pH8.2）、4.2mL蒸餾水在25mL的試管中混勻后在37℃水浴中保溫20min，取出后立即加入在37℃預熱過的3mmol/L鄰苯三酚0.5mL，迅速搖勻后倒入比色皿，325nm下每隔30s測定吸光度，計算線性范圍內(nèi)每分鐘內(nèi)吸光度的增加，以10mmol/L HCl溶液配制空白管作為對照，記錄結果。

按照上述步驟在加入鄰苯三酚前先分別加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL的各樣品液，蒸餾水相應減少。同樣以10mmol/L HCl溶液配制空白管作為對照。測定吸光度，每個樣品均重復3次，取其平均值。

1.2.5.2 抑制率計算方式

式中：△A1/△t為鄰苯三酚自氧化時反應速率；△A2/△t為加入樣品液后鄰苯三酚自氧化時反應速率。

2 結果與分析

2.1 最佳工藝的確定

取四組樣品，分別對其進行以下處理：1號微波處理10min、單一酶水解；2號微波處理10min、復合酶水解；3號無微波處理、單一酶水解；4號無微波處理、復合酶水解。水解度測定結果分別為：37.21%、40.02%、36.45%、29.35%。

對水解后的酶解液進行凱氏定氮，結果如下：1號11.58mg N/mL、2號33.03mg N/mL、3號15.98mg N/mL、4號20.12mg N/mL。

綜合上述數(shù)據(jù)可得，微波處理加熱、雙酶協(xié)同水解的效果最佳。

2.2 分子量的測定

本實驗選用VB12和L-色氨酸作為標準樣品。VB12、L-色氨酸的凝膠過濾層析圖譜如圖1、圖2所示。

圖1 L-色氨酸凝膠過濾層析圖譜Fig.1 Gel Filtration Chromatography Map of L-tryptophan

圖2 VB12凝膠過濾層析圖譜Fig.2 Gel Filtration Chromatography Map of VB12

由圖1可知，L-色氨酸凝膠過濾層析圖譜中只出現(xiàn)一個峰值，表明L-色氨酸樣品（MW 204u）的純度達到要求，經(jīng)測定L-色氨酸在169mL處有最大吸收峰。由于色氨酸是分子量最大的氨基酸，而本實驗所研究的大豆肽分子量均大于204u。因此將L-色氨酸作為標準物質(zhì)的下限是可行的。

由圖2可知，VB12凝膠過濾層析圖譜中出現(xiàn)兩個峰值，說明VB12樣品（MW 1355u）的純度未達到要求。為確定VB12的最終洗脫體積，還需要進一步檢測其吸光度。VB12在紫外吸收光譜上有三個吸收峰，分別為278、361、550nm，并且在361nm處的吸收峰干擾因素最少，吸收能力最強。因此選擇在波長為361nm的紫外線分光光度計下檢測其吸光度。經(jīng)測定可以得知VB12在90～100mL時具有最大吸收峰。本課題所研究的大豆肽分子量分布范圍約為300～1000u，因此將VB12作為標準物質(zhì)的上限是可行的。

圖3 水解6h酶解液的凝膠過濾層析圖譜Fig.3 Gel filtration chromatography Map of hydrolysis for 6h

表1 水解玉米胚芽生產(chǎn)玉米肽的分子量分布（%）Table 1 Molecular weight distribution of corn peptide in hydrolysis of corn germ（%）

2.3 鄰苯三酚自氧化速率

每隔30s所測鄰苯三酚自氧化速率吸光值結果見表2。由表2可知，鄰苯三酚自氧化速率ΔA1/Δt=0.037。

表2 鄰苯三酚自氧化速率Table 2 Autoxidation rate of Pyrogallol

2.4 不同濃度玉米胚芽肽抗氧化速率

MW＞1355u命名為組分1，MW＜204u命名為組分2。

表3 不同組分的抑制率（%）Table 3 The Inhibitory rate of different Components（%）

圖4 組分1對超氧自由基的抑制率曲線Fig.4 The curve of the Inhibitory rate for the component 1

由圖4和圖5可知，組分1的IC50為1.06mg，組分2的IC50為2.20mg。組分1對超氧自由基的清除能力大于組分2。

3 結論

微波作為一種強化反應的技術，可以加速分子間的運動，提高分子的平均能量，大幅度提高反應的速率和產(chǎn)率。

利用超聲波對玉米蛋白進行預處理，可顯著地對玉米蛋白進行破壁，有利于酶發(fā)揮水解作用，提高玉米蛋白的水解度，并且縮短水解時間。

雙酶協(xié)同作用增加了蛋白質(zhì)催化位點，與傳統(tǒng)的單一酶水解相比能更有效地將玉米蛋白分解成相對分子質(zhì)量低的小分子玉米肽。

由實驗結果可得出如下結論：微波處理加熱、雙酶協(xié)同水解可以提高酶解得率。水解后得到的多肽主要分子量分布在＞1355u和＜204u。MW＞1355u的組分對超氧自由基的清除能力大于MW＜204u。

圖5 組分2對超氧自由基的抑制率曲線Fig.5 The curve of the Inhibitory rate for the component 2

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Microwave heating to hydrolyze corn protein into low molecular weight peptides by enzyme’s cooperation

LI Li，CUI Bo*
（Shandong Institute of Light Industry，Jinan 250353，China）

Microwave was used to hydrolysis corn protein into low molecular weight peptides by enzymes cooperation.Using hydrolysis degree as standards the optimized conditions of one enzyme hydrolysis，the best condition of low molecular weight of corn polypeptides was determined.The peptides were separated by Sephadex G-15.Determine the inhibitiory ability of two components of super oxygen free radical.The result showed that the fraction with molecular weight more than 1355u displayed higher antioxidant activity.

corn protein；enzymatic hydrolysis；antioxidant

TS210.1

B

1002-0306（2012）01-0285-04

2010－11－05 *通訊聯(lián)系人

李麗（1985-），女，碩士研究生，研究方向：功能性食品與食品添加劑。