任 健，師俊玲

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西楊凌712100）

在模擬體系中研究發(fā)酵條件對(duì)紅葡萄酒中白藜蘆醇含量的影響

任 健，師俊玲*

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西楊凌712100）

以陜西省涇陽(yáng)產(chǎn)赤霞珠葡萄為原料，通過(guò)二次正交旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究了模擬體系中初始pH、SO2、溫度以及酒精度對(duì)葡萄中白藜蘆醇溶出的影響，建立了各因素影響的回歸方程，并對(duì)其進(jìn)行了響應(yīng)曲面分析，建立了預(yù)測(cè)模型。關(guān)鍵詞：葡萄酒，浸漬，白藜蘆醇，影響，響應(yīng)面

白藜蘆醇是植物體內(nèi)天然的二苯乙烯類(lèi)多酚物質(zhì)（3，4’，5-三羥基二苯乙烯），是葡萄酒中重要的生物活性物質(zhì)，具有預(yù)防和減少一系列疾病和延長(zhǎng)生物體壽命等作用[1-5]。除非微生物發(fā)酵過(guò)程或葡萄中組分反應(yīng)能夠產(chǎn)生新的白藜蘆醇，葡萄酒中白藜蘆醇的最終含量水平實(shí)際上是葡萄中白藜蘆醇的浸出程度及其在酒中穩(wěn)定性的綜合反映。葡萄酒的釀造過(guò)程實(shí)際上是一個(gè)分批發(fā)酵的過(guò)程，在這一過(guò)程中，酒醪中的酒度、糖度、溫度、酸度等因素都會(huì)處于不斷變化的狀態(tài)，這種變化會(huì)直接影響到葡萄中白藜蘆醇的浸出量和穩(wěn)定性。掌握各種條件對(duì)酒中白藜蘆醇含量的影響規(guī)律對(duì)于及時(shí)終止發(fā)酵和控制發(fā)酵過(guò)程向有利于提高酒中白藜蘆醇含量的方向發(fā)展有重要意義。葡萄果實(shí)中白藜蘆醇含量水平是決定葡萄酒中白藜蘆醇含量的主要因素。它主要與葡萄品種、栽培方式、生態(tài)條件、環(huán)境脅迫等條件有關(guān)[6]。在酵母中轉(zhuǎn)入白藜蘆醇合成過(guò)程的關(guān)鍵酶基因可以在發(fā)酵過(guò)程中生成一定的白藜蘆醇[7]；通過(guò)對(duì)葡萄進(jìn)行采后短期缺氧和冷凍處理也能提高葡萄中白藜蘆醇含量[8]。此外，發(fā)酵過(guò)程中所用的酵母菌種、葡萄品種和生產(chǎn)年份、SO2和果膠酶的添加以及澄清劑的使用對(duì)葡萄酒中白藜蘆醇含量產(chǎn)生一定影響[9-14]，但有關(guān)這種現(xiàn)象的產(chǎn)生機(jī)制并不清楚。就理論分析，在葡萄原料確定的條件下，除非與白藜蘆醇發(fā)生反應(yīng)，這些因素對(duì)酒中白藜蘆醇含量的影響主要是通過(guò)酒醪特性的改變來(lái)影響白藜蘆醇浸出量和穩(wěn)定性從而實(shí)現(xiàn)的。關(guān)于葡萄酒釀造過(guò)程中與白藜蘆醇有關(guān)的化學(xué)反應(yīng)尚未見(jiàn)報(bào)道。為了探討發(fā)酵過(guò)程中的主要因素對(duì)葡萄酒中白藜蘆醇含量的影響機(jī)制，本文重點(diǎn)考察了pH、SO2添加量、酒精度和溫度對(duì)葡萄中白藜蘆醇溶出量的影響，并通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和二次正交旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)，結(jié)合響應(yīng)面分析方法（RSM）對(duì)這些指標(biāo)水平進(jìn)行了優(yōu)化，以期獲得能夠使白藜蘆醇最大量地進(jìn)入葡萄酒中的最優(yōu)條件，從而為紅葡萄酒的釀造過(guò)程提供理論參考；并在白藜蘆醇浸出量的角度上闡明主要釀造條件影響葡萄酒中白藜蘆醇含量的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

赤霞珠葡萄 于2009年9月采于陜西涇陽(yáng)縣；白藜蘆醇標(biāo)品 購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所；甲醇 色譜純；H2SO3、HCl、NaOH、乙醇等 均為市售分析純。

Waters600E高效液相色譜儀 美國(guó)waters；ZSD-1160培養(yǎng)箱 上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；T-203電子天平 美國(guó)丹佛；pH-3C酸度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；高壓液相色譜儀 美國(guó)Waters，配有C18柱（5μm，250mm× 4.6mm）和UV檢測(cè)器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理 挑選同批采摘、顏色大小相近、完熟的赤霞珠葡萄為原料，破碎后對(duì)其稱(chēng)重、測(cè)體積，在－40℃下冷凍保存，用作實(shí)驗(yàn)原料。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 稱(chēng)取葡萄100g左右準(zhǔn)確稱(chēng)重，破碎后置于三角瓶中，在維持其他條件不變的條件下，分別改變溫度、pH、酒精度和SO2濃度，考察各因素對(duì)葡萄浸出的葡萄汁液中白藜蘆醇含量的影響。當(dāng)一個(gè)因素變化時(shí)，其他因素的水平分別固定為：溫度28℃，pH3.2，酒精度0°，SO2濃度0mg/L。各因素變化范圍為：溫度：12、20、28、32℃；初始pH：2.8、3.2、3.5、4.0；酒精度：0°、7°、12°、16°；SO2濃度：30、60、90、120mg/L。其中，pH用NaOH進(jìn)行調(diào)節(jié)，酒精度用無(wú)水乙醇進(jìn)行調(diào)節(jié)，SO2濃度用H2SO3溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)。在不同條件下處理17h后，混合均勻后取汁液部分測(cè)定其中的白藜蘆醇含量。

1.2.3 二次正交旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取pH、SO2濃度、酒精度和溫度的考察水平，用Design－Expert 7.00軟件，按照可旋轉(zhuǎn)的中心組合設(shè)計(jì)方法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，因素水平見(jiàn)表1。

表1 二次正交旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平編碼表Table 1 Codes of the factors and levels in the central composite design

1.2.4 白藜蘆醇含量的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[15－16]，以及GB/T15038－2005葡萄酒、果酒通用分析方法附錄中[17]有關(guān)白藜蘆醇含量的測(cè)定方法進(jìn)行樣品前處理。具體方法為：取葡萄酒醪20.0mL，加入2.0g NaCl溶解后，再加20.0mL乙酸乙酯振蕩萃取30min，分出有機(jī)相，加入3.0g無(wú)水硫酸鈉除去其中的水分，重復(fù)一次，在50℃水浴中真空蒸發(fā)，真空度為0.06～0.08MPa。加2.0mL甲醇溶解剩余物，移到離心管中置于冰柜中冷凍待測(cè)。以上所有操作應(yīng)盡量在避光的條件下進(jìn)行。采用外標(biāo)法用液相色譜法測(cè)定其白藜蘆醇含量，所用色譜柱為C18柱（5μm，250×4.6mm），流動(dòng)相為乙腈∶水=30∶70，進(jìn)行等壓洗脫，流速為1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為306nm，進(jìn)樣量為20μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 初始pH的影響 葡萄果實(shí)的pH在成熟過(guò)程會(huì)從2.8升到3.5或者更高，葡萄酒進(jìn)行蘋(píng)果酸－乳酸發(fā)酵時(shí)的pH在3.1～3.4之間[18]。為了結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)情況，本文主要考察了pH在2.8到4.0之間變化時(shí)，葡萄中白藜蘆醇向酒醪中的浸出情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖1），酒醪中的白藜蘆醇含量隨著pH的變大先略有減小，至pH3.5時(shí)降到最低值2.30mg/L；此后，隨著pH的增大，白藜蘆醇含量有所增加，至pH4.0時(shí)達(dá)到最大的4.26mg/L。這說(shuō)明，較高的pH有利于葡萄中白藜蘆醇的溶出。但是，高pH會(huì)導(dǎo)致酒醪容易染菌；而且，釀酒的葡萄自然pH均較低，加工過(guò)程中SO2的加入會(huì)使酒醪pH進(jìn)一步降低，在現(xiàn)有工藝條件下要使酒醪控制在較高的pH水平是不切實(shí)際的。

圖1 pH對(duì)白藜蘆醇溶出的影響Fig.1 Effect of pH on resveratrol content in dissloution

2.1.2 酒精度的影響 在葡萄酒的釀造過(guò)程中，隨著釀造過(guò)程的進(jìn)行，酒醪中的酒精度會(huì)不斷升高。在現(xiàn)有工藝條件下，葡萄酒的最終酒精度一般在7°至16.2°之間。為此，本文重點(diǎn)考察了酒精度在7°至16.2°之間變化時(shí)，酒醪中白藜蘆醇含量的變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖2），隨著酒精度的增大，酒醪中白藜蘆醇含量明顯增大；當(dāng)酒精度從0°增大至16°時(shí)，酒醪中白藜蘆醇含量由2.51mg/L增大至9.24mg/L。這說(shuō)明，較高的酒精度有利于葡萄中白藜蘆醇的溶出；這與白藜蘆醇提取時(shí)需要較高的酒精濃度相一致，也是白藜蘆醇易溶于酒精的特性所決定的[19]。因此，在葡萄酒的釀造過(guò)程中，維持較高的酒精度，有助于提高酒中白藜蘆醇的最終含量。

圖2 酒精度對(duì)白藜蘆醇溶出的影響Fig.2 Effect of alcoholic strength on resveratrol content in dissloution

圖3 SO2對(duì)白藜蘆醇溶出的影響Fig.3 Effect of sulfur dioxide on resveratrol content in dissloution

2.1.3 SO2濃度的影響 在葡萄酒的釀造過(guò)程中，通常需要加入SO2防止氧化反應(yīng)和抑制其它雜菌的生長(zhǎng)。一般情況下，根據(jù)葡萄果實(shí)中含酸量的高低，葡萄酒釀造過(guò)程中SO2的使用量通常在30～80mg/L之間；破損霉變的果實(shí)較多時(shí)，SO2添加量在80～100mg/L之間[20]。SO2的添加量較高時(shí)，會(huì)抑制乳酸菌的生長(zhǎng)，對(duì)蘋(píng)果酸－乳酸發(fā)酵過(guò)程不利[20]?？紤]到食品衛(wèi)生安全問(wèn)題，本文重點(diǎn)研究了SO2添加量在30mg/L至120mg/L之間變化時(shí)，酒醪中白藜蘆醇含量的變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖3），酒醪中白藜蘆醇含量呈現(xiàn)2.5mg/L至3.7mg/L的波動(dòng)，與SO2的添加量間未表現(xiàn)出明顯的規(guī)律關(guān)系。

2.1.4 溫度的影響 大量研究結(jié)果表明，紅葡萄酒的最佳發(fā)酵溫度為26～30℃，蘋(píng)果酸－乳酸發(fā)酵的最佳溫度為18～20℃[21]。溫度高于32℃時(shí)，酵母繁殖速度下降，酵母疲勞。結(jié)合葡萄酒釀造時(shí)的溫度條件，本文重點(diǎn)考察了溫度在12℃至32℃之間變化時(shí)，酒醪中白藜蘆醇含量的變化情況。結(jié)果顯示（圖4），酒醪中白藜蘆醇含量在溫度低于20℃時(shí)無(wú)顯著變化，但當(dāng)溫度從20℃升至32℃時(shí)則出現(xiàn)顯著增加。這說(shuō)明，升高溫度有利于葡萄中白藜蘆醇的溶出。但是，在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，升高溫度會(huì)引起雜菌的滋生和熱敏性物質(zhì)的破壞與損失，而且會(huì)導(dǎo)致香氣成分的逸失。因此，在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，一味地提高釀造溫度也是不可取的。

圖4 溫度對(duì)白藜蘆醇溶出的影響Fig.4 Effect of temperature on resveratrol content in dissloution

2.2 二次正交旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

除酒精度的影響實(shí)驗(yàn)以外，上述單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果都是在酒醪中酒精度為0的條件下進(jìn)行的。所得結(jié)果不能體現(xiàn)葡萄酒釀造過(guò)程中酒精度不斷升高的實(shí)際情況，也不能反映各因素之間交互作用的影響。為了進(jìn)一步摸清各因素對(duì)酒醪中白藜蘆醇含量的綜合影響，本文在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，將實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)一步擴(kuò)大，以初始pH4.5、SO2濃度60mg/L、酒精度10°、溫度25℃為中心點(diǎn)，按照二次正交旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。用Design－Expert 7.00對(duì)表2中所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，可得以白藜蘆醇含量為因變量的函數(shù)關(guān)系，如方程（1）和方程（2）所示。對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示。

采用水平代碼所得回歸方程為：

采用實(shí)際值所得回歸方程為：

表2 二次正交旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 Central composite experimental design and results

表3 二次響應(yīng)面模型方差分析和回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 3 Analysis of variance and significance of the response surface quadratic regression model

由表3可以看出，所得回歸模型達(dá)極顯著水平（P＜0.0001），R2=0.8876，說(shuō)明僅有11.2%變異的不能由該模型解釋。模型中的因素C（酒精度）、D（溫度）和C2達(dá)到了極顯著水平；A和B的影響不顯著（p＞0.1）。

由方程1中各因素對(duì)應(yīng)的回歸系數(shù)絕對(duì)值可以看出，各因素一次項(xiàng)對(duì)白藜蘆醇含量的影響次序?yàn)镃＞D＞A＞B，即酒精度的影響最大，其次為溫度、pH，SO2添加量的影響最小。

固定方程1中三個(gè)因素為零水平，可得出另一因素對(duì)白藜蘆醇的影響規(guī)律，如圖5所示。由圖5可以看出，當(dāng)其它因素固定不變時(shí)，酒醪中白藜蘆醇含量隨著因素D（溫度）的增大呈直線上升，隨著因素C（酒精度）的增大呈指數(shù)上升，隨著因素A（pH）和因素B（SO2添加量）的增大呈二次拋物線上升。此處所得結(jié)果中，除了溫度和酒精度的影響與單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較吻合以外，pH和SO2添加量的影響規(guī)律與單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果不符。這是因?yàn)?，前述單因素?shí)驗(yàn)中各因素的0水平與此處有所不同。這也說(shuō)明，各因素的影響之間存在著較強(qiáng)的交互作用。

圖5 實(shí)驗(yàn)中不同因素對(duì)白藜蘆醇含量影響的回歸曲線Fig.5 Contours plots of factors on resveratrol content in design

圖6 溫度和酒精度對(duì)白藜蘆醇溶出的影響Fig.6 Response surface（3D）showing the effect of temperature and alcohol on resveratrol dissloution

圖7 溫度和SO2對(duì)白藜蘆醇溶出的影響Fig.7 Response surface（3D）showing the effect of temperature and SO2on resveratrol dissloution

使用Design－Expert 7.00軟件對(duì)正交旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)中交互作用達(dá)顯著水平幾個(gè)因素作響應(yīng)曲面分析，結(jié)果如圖6～圖8所示。由圖可以看出兩個(gè)因素同時(shí)變化時(shí)對(duì)響應(yīng)值的影響趨勢(shì)，但是，在本文所考察的因素水平范圍內(nèi)，這些響應(yīng)曲面并未出現(xiàn)峰值區(qū)間。這說(shuō)明，在現(xiàn)有的葡萄酒生產(chǎn)工藝條件下，無(wú)論怎么組合，也達(dá)不到使酒中白藜蘆醇含量達(dá)到最高值的理想條件。但是，由此可以看出，維持較高的發(fā)酵溫度和酒精度，或者在葡萄酒釀造過(guò)程中保持pH和SO2添加量在實(shí)驗(yàn)數(shù)值范圍以?xún)?nèi)，均能使酒中白藜蘆醇含量達(dá)到較高的水平。

圖8 溫度和pH對(duì)白藜蘆醇溶出的影響Fig.8 Response surface（3D）showing the effect of temperature and pH on resveratrol dissloution

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用二次旋轉(zhuǎn)正交實(shí)驗(yàn)方案考察了初始溫度、SO2添加量、酒精度以及初始pH對(duì)葡萄酒糟中白藜蘆醇溶出的影響；利用響應(yīng)面分析方法建立了各因素對(duì)白藜蘆醇溶出的二次多項(xiàng)式模型，對(duì)模型進(jìn)行了方差分析，結(jié)果表明：模型擬合程度高、實(shí)驗(yàn)誤差較小。研究為以最大限度地保留葡萄酒中白藜蘆醇為目標(biāo)的紅葡萄酒發(fā)酵提供了一定理論基礎(chǔ)。但是對(duì)于發(fā)酵過(guò)程中各因素對(duì)葡萄酒白藜蘆醇含量變化的影響，還需在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行探索。

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Effect of fermentation conditions on the resveratrol of wine in simulation system

REN Jian，SHI Jun-ling*
（College of Food Science and Engineering，Northwest Aamp;F University，Yangling 712100，China）

Central composite design was used to study the effect of initial pH，sulfur dioxide，temperature and alcoholic strength on content of resveratrol in wine in simulation system.A quadratic regression model was obtained for the resveratrol content in wine corresponding to the four parameters.The response surface method was also used to analyze the data and finally establish the forecast model.

wine；maceration；resveratrol；effect；response surface

TS262.6

A

1002-0306（2012）01-0175-05

2010－12－08 *通訊聯(lián)系人

任?。?985-），男，碩士，研究方向：食品生物技術(shù)。