劉 玲，劉 茜，王 紅

（沈陽農(nóng)業(yè)大學食品學院，遼寧沈陽110866）

啤酒糟蛋白中高F值寡肽的制備

劉 玲，劉 茜，王 紅

（沈陽農(nóng)業(yè)大學食品學院，遼寧沈陽110866）

以啤酒糟為原料，采用雙酶水解法制備高F值寡肽。通過對蛋白質水解度的測定，采用響應面法進行優(yōu)化，得出雙酶水解最佳條件為：堿性蛋白酶加酶量為6%、酶解時間4h、pH8.6、酶解溫度56℃；木瓜蛋白酶的加酶量為3%、酶解時間3h、pH6.3、酶解溫度48℃。用活性炭吸附酶解液，去除其中的芳香族氨基酸，采用G-25葡聚糖凝膠分離純化，測其分子質量為794.24u，此時的F值為21.02。

啤酒糟蛋白，酶解，響應面法（RSM），高F值寡肽

F值是指支鏈氨基酸（BCAA）與芳香族氨基酸（AAA）的摩爾比值[1]。高F值寡肽即是由動、植物蛋白酶解后制得的具有高支鏈、低芳香族氨基酸組成的寡肽，具有消除或減輕肝性腦病癥狀、改善肝功能和蛋白質營養(yǎng)失常狀態(tài)及抗疲勞等功能[2]。一般認為，F(xiàn)值大于20時具有治療效果[3]。啤酒糟（BSG）是啤酒生產(chǎn)過程中最大量的副產(chǎn)物，它是由麥芽和未發(fā)芽谷物原料在啤酒糖化中的不溶解物質組成的[4]。其營養(yǎng)成分為：蛋白質24%～28%，脂肪8%～11%，纖維素55%～61%，糖分1%～3%，灰分3%～5%。我國啤酒糟主要作為飼料使用，很少一部分用來生產(chǎn)食醋[5]。近年來，人們致力于將麥糟轉化為高蛋白質源和飲食纖維源的研究，以提高麥糟的應用價值。本研究采用多次水洗法提取啤酒糟蛋白，然后采用響應面法對水提啤酒糟蛋白的兩次酶解條件進行優(yōu)化，酶解液經(jīng)過分離純化后得到高F值寡肽。該高F值寡肽的制備有利于更大程度地開發(fā)啤酒糟蛋白質再生資源，擴大其使用范圍，實現(xiàn)經(jīng)濟效益和社會效益雙豐收。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

啤酒糟 沈陽華潤雪花啤酒廠；堿性蛋白酶諾維信（中國）生物技術有限公司；木瓜蛋白酶 國藥集團沈陽化學試劑有限公司；其他試劑 均為分析純。

膠體磨 新光動力機械公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-6 國華電器有限公司；TD25-WS低速自動平衡離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；pH S-25酸度計 上海雷磁儀器廠；TU-1810紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；日立835-50氨基酸自動分析儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取蛋白 濕啤酒糟水浸泡一段時間，膠體磨粉碎、過篩，去除篩上物，離心、沉淀水洗，重復3～5次。棄去上清液，沉淀干燥、粉碎，得到啤酒糟蛋白。

1.2.2 高F值寡肽制備[6]啤酒糟蛋白纖維素酶[7]水解后，分別加入堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解、離心，上清液活性炭吸附過濾，得到寡肽混合物，透析脫鹽，SephadexG-25柱分離純化，得到高F值寡肽溶液，濃縮干燥得到高F值寡肽干品。

1.2.3 水解度的測定 甲醛電位滴定法[8]。

1.2.4 分子量大小的測定 采用SephadexG-25凝膠裝柱，上樣量為1mL，雙蒸水1mL/min的速度洗脫，流出液280nm檢測，根據(jù)寡肽溶液的洗脫體積，用凝膠層析法[8-9]測其相對分子質量。

1.2.5 氨基酸分析和F值的測定 通過氨基酸自動分析儀測定酶解液中氨基酸的組成成分，計算F值。

1.2.6 酶解條件的單因素實驗

1.2.6.1 加酶量對水解度的影響 取5份啤酒糟蛋白，每份2g，1∶10料液比加水，纖維素酶水解，離心取濾渣，50℃、pH9.0條件下分別加入堿性蛋白酶1%、3%、5%、7%、9%，恒溫酶解4h，4000r/min離心15min，取上清液，定容至100mL，測量pH，記錄NaOH消耗，計算其水解度。

1.2.6.2 溫度對水解度的影響 pH9.0，加酶量5%，時間4h條件下，溫度分別為45、50、55、60、65℃，其余做法同上，記錄NaOH消耗，計算其水解度。

1.2.6.3 時間對水解度的影響 50℃，pH9.0，加酶量5%的條件下，時間分別為2、3、4、5、6h，其余做法同上，記錄NaOH消耗，計算其水解度。

1.2.6.4 pH對水解度的影響 50℃，加酶量5%，4h條件下，pH分別為7.5、8.0、8.5、9.0、9.5，其余做法同上，記錄NaOH消耗，計算其水解度。

1.2.7 響應面法對酶解條件的優(yōu)化 綜合單因素實驗結果，根據(jù)Box-Benhnken的中心組合實驗設計原理，采用響應面法在3因素3水平上對啤酒糟蛋白的酶解條件進行優(yōu)化，設計采用15個實驗點，1～12為析因實驗，13～15為中心實驗，析因點為自變量，取值在X1、X2、X3所構成的三維頂點，0點為區(qū)域的中心點，0點實驗重復3次。實驗因素和水平見表1。

表1 響應面分析因素及水平表Table 1 Factors and levels table of RSM analysis

2 結果與討論

2.1 單因素實驗結果

圖1 加酶量對水解度的影響Fig.1 Effect of the amount of enzyme on the degree of hydrolysis

2.1.1 加酶量對水解度的影響 由圖1可知，加酶量從1%～5%遞增，水解度顯著增加；從5%增加到9%水解度的變化不大，考慮成本選擇最適加酶量為5%。

2.1.2 溫度對水解度的影響 由圖2可知，在55℃之前，水解度隨溫度的升高不斷增加，55℃時達到最大。之后由于溫度過高使部分酶失活，水解度開始下降，所以選擇最佳酶解溫度為55℃。

圖2 溫度對水解度的影響Fig.2 Effect of hydrolysis temperature on the degree of hydrolysis

2.1.3 時間對水解度的影響 由圖3可知，水解度在4h之前增加較明顯，之后水解度的變化較平緩，逐漸趨于一條直線，為了節(jié)省時間，選擇最佳的酶解時間為4h。

圖3 時間對水解度的影響Fig.3 Effect of hydrolysis time on the degree of hydrolysis

2.1.4 pH對水解度的影響 由圖4可知，pH7.5～8.0時，水解度增加比較緩慢；pH8.0后，水解度增加比較顯著；當pH8.5時達到最大的水解度，之后緩慢下降；當pH＞9.0時，水解度顯著下降，所以選擇最佳的酶解pH為8.5。

圖4 pH對水解度的影響Fig.4 Effect of pH on the degree of hydrolysis

2.2 響應面分析

2.2.1 回歸模型的建立及方差分析 在單因素實驗結果基礎上，確定水解時間為4h。采用Box-Benhnken的中心組合實驗設計原理，分析三個主要因素加酶量（%）、酶解溫度（℃）及pH，分別用X1、X2、X3來表示，并以1、0、-1代表變量水平，以x1=（X1-5）/2，x2=（X2-55）/5，x3=（X3-8.5）/0.5為自變量，以水解度Y為響應值進行響應面分析實驗，實驗結果見表2。

表2 響應面實驗方案與結果Table 2 Test design and result of RSM

表3 回歸系數(shù)分析Table 3 Analysis of regression coefficient

表4 回歸方程方差分析Table 4 Variance analysis of regression equation

以啤酒糟蛋白的水解度為響應值（Y），采用Minitab15統(tǒng)計軟件對實驗結果進行回歸分析，經(jīng)過回歸擬合得到回歸模型方程為：

Y=-378.94800+437.68800X1+3.15575X2+ 67.64750X3-690.62500X12-0.03905X22-4.25500X32+ 0.10000X1X2-40.00000X1X3+0.14700X2X3

為了說明回歸方程的有效性及各因素對水解度的影響程度，對回歸方程進行了回歸系數(shù)及其方差分析，見表3和表4。由表3和表4對回歸方程的分析可知，R2=0.9910，模型的顯著水平遠遠小于0.01，此時回歸模型是極顯著的，說明該方程能正確反映水解度與加酶量、酶解溫度及pH之間的關系，證明該實驗方法可靠。由表4可知，一次項、二次項及交互作用的P值都小于0.05，達到顯著水平。又由表3可知，X1、X2、X3、X12、X22、X32、X1X3、X2X3對響應值Y的影響都極顯著，只有交互項中X1X2不顯著，這表明實驗因子對響應值不是簡單的線性關系。方程的失擬誤差表現(xiàn)不顯著，進一步說明各因素和響應值之間的關系可以用此模型來函數(shù)化，可用該回歸方程代替實驗真實點對實驗結果進行分析。

圖5 溫度與加酶量交互作用對水解度的影響Fig.5 Combined effect of temperature and the amount of enzyme on the degree of hydrolysis

圖6 溫度與pH交互作用對水解度的影響Fig.6 Combined effect of temperature and pH on the degree of hydrolysis

圖7 pH與加酶量交互作用對水解度的影響Fig.7 Combined effect of pH and the amount of enzyme on the degree of hydrolysis

2.2.2 水解度的響應面分析及優(yōu)化 圖5～圖7給出了各個因子交互作用對水解度的影響。圖5為溫度與加酶量交互作用對水解度的影響，當溫度為55℃時，加酶量增加則水解度隨之增加；當溫度過高或過低時，無論加酶量如何變化水解度都降低，但交互作用對水解度的影響不是很顯著。圖6為溫度與pH交互作用對水解度的影響，從響應面的最高點可以看出，在所選范圍內(nèi)存在極值，說明溫度與pH的共同作用對水解度的影響較大。圖7為pH與加酶量交互作用對水解度的影響，隨著pH和加酶量的增加，水解度也隨之增加，pH增加到8.6時水解度達到最大，繼續(xù)增加水解度又會降低，圖5～圖7與回歸方程的方差分析相吻合。

由Minitab15統(tǒng)計軟件分析得到最大響應值時x1=0.265，x2=0.252，x3=0.192。與其對應的最佳酶解條件為：加酶量5.53%，酶解溫度為56.26℃，pH為8.55，理論最大水解度為15.76%，為了檢驗響應面法的可行性，采用最佳條件進行驗證實驗，同時考慮實際操作的便利性，以加酶量6%，酶解溫度56℃，pH8.6進行3次重復，水解度平均值為15.36%，與理論值有0.40%的偏差，由此可見此酶解條件是可行的。

表5 高F值寡肽中氨基酸的種類及含量（mmol）Table 5 Components and contents of amino acids in BSG’s high F ratio oligo-peptide（mmol）

2.3 木瓜蛋白酶及活性炭的用量

第二步采用木瓜蛋白酶[11]對酶解液進一步酶解，酶解最優(yōu)條件同樣采用響應面優(yōu)化法（圖略），得到加酶量3%，酶解溫度48℃，酶解時間3h，pH6.3為最適酶解條件；活性炭[12]在固液比1∶10，溫度30℃，時間2h，pH3.0的條件下靜態(tài)吸附酶解液中的芳香族氨基酸。

2.4 分子量的測定

采用SephadexG-25將制得的酶解液進行分離純化，選取鉻酸鉀、還原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、維生素B12、Nisin為標準品，1mL/min的雙蒸水洗脫，280nm收集流出液，根據(jù)各標準物質的洗脫體積，作出標準曲線（如圖8），其中第3點為寡肽溶液的洗脫體積。然后根據(jù)寡肽溶液的洗脫體積，采用凝膠層析方法測其相對分子質量為794.24u。

圖8 標準物質的洗脫體積與分子質量的關系Fig.8 The relationship between elution volume and molecular weight of control sample

2.5 啤酒糟蛋白高F值寡肽的氨基酸組成

見表5。

2.6 啤酒糟蛋白F值的計算

由表5可得，BCAA=2.145+1.167+4.236=7.548， AAA=0.241+0.118=0.359，F(xiàn)=7.548/0.359=21.02＞20。

3 結論

本文在單因素實驗的基礎上，采用響應面法，經(jīng)優(yōu)化得到最適酶解條件：堿性蛋白酶的加酶量為6%，酶解時間4h，pH8.6，酶解溫度56℃，水解度為15.36%；木瓜蛋白酶的加酶量3%，酶解溫度48℃，酶解時間3h，pH6.3，水解度為13.78%。得到的酶解液在活性炭與酶解液的固液比1∶10，溫度30℃，時間2h，pH3.0的條件下采用靜態(tài)吸附法吸附酶解液中的芳香族氨基酸。然后采用SephadexG-25對酶解液進行分離純化，凝膠層析法測定其分子量為794.24u，酶解液用氨基酸自動分析儀測定其氨基酸組成成分，計算F值為21.02，滿足高F值寡肽的要求。

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Preparation of high ficher ratio oligo-peptide from protein of brewer’s spent grains

LIU Ling，LIU Qian，WANG Hong
（College of Food Science，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110866，China）

High ficher ratio oligo-peptide was achieved from the protein of brewer’s spent grains by the way of double enzymatic hydrolysis.The degree of hydrolysis was optimized by RSM，the optimum conditions of protease were established：the amount of alkaline protease was 6%、time was 4h，pH was 8.6，temperature was 56℃.The amount of papain was 3%，time was 3h，pH was 6.3，temperature was 48℃.The hydrolysis fluid was absorbed in active carbon in order to remove the aromatic amino acids and was purified by G-25 gel flirtation chromatography，then determined the molecular weight was 794.24u and the high F value was 21.02.

protein of brewer’s spent grain（BSG）；enzymatic hydrolysis；response surface methodology（RSM）；high ficher ratio oligo-peptide

TS201.1

B

1002-0306（2012）09-0309-04

2011-07-22

劉玲（1973-），女，博士，副教授，主要從事食品質量安全的教學和科研工作。