冮 潔，劉 冰

（大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連116600）

采用響應(yīng)面法優(yōu)化杏鮑菇菌絲體多糖提取工藝

冮 潔，劉 冰

（大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連116600）

采用響應(yīng)面法對(duì)杏鮑菇菌絲體胞內(nèi)多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以多糖得率為響應(yīng)值，確定了實(shí)驗(yàn)參數(shù)的水平范圍。結(jié)果表明：液固比、浸提溫度、浸提時(shí)間和乙醇用量等因素對(duì)多糖得率的影響具顯著性；杏鮑菇菌絲體多糖提取的最佳工藝參數(shù)為：液固比30∶1mL/g、浸提溫度97℃、浸提時(shí)間1.8h、乙醇用量是浸提液的2.5倍，浸提1次，在該工藝條件下杏鮑菇菌絲體多糖得率為8.65%。

杏鮑菇，菌絲體，多糖，提取，響應(yīng)面法

杏鮑菇（Pleurotus eryngii）是真菌門、擔(dān)子菌亞門、真擔(dān)子菌綱、傘形目、側(cè)耳科、側(cè)耳屬真菌，是大型肉質(zhì)菌[1]。杏鮑菇肉質(zhì)肥厚，味道鮮美，兼有鮑魚和杏仁的香味，是一種很受消費(fèi)者歡迎的食用菌。杏鮑菇營(yíng)養(yǎng)豐富，經(jīng)常食用具有降血脂、降膽固醇、促進(jìn)胃腸消化、增強(qiáng)機(jī)體免疫力的功效[2-3]。杏鮑菇真菌多糖不僅存在于子實(shí)體中，其菌絲體也是多糖的主要來(lái)源，并且液態(tài)深層發(fā)酵具有生產(chǎn)周期短、生長(zhǎng)條件易控制、產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)[4]。目前杏鮑菇多糖開(kāi)發(fā)多集中在子實(shí)體多糖上，杏鮑菇菌絲體多糖的開(kāi)發(fā)研究相關(guān)報(bào)道甚少。金周雨等對(duì)杏鮑菇菌絲體多糖培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化[5]。為深入開(kāi)發(fā)利用這一珍稀食（藥）用菌資源，本文對(duì)杏鮑菇菌絲體胞內(nèi)多糖的提取條件進(jìn)行了研究，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對(duì)杏鮑菇液體培養(yǎng)菌絲體所產(chǎn)胞內(nèi)多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定杏鮑菇菌絲體胞內(nèi)多糖提取工藝的最佳參數(shù)，為其進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

杏鮑菇（Pleurotus eryngii） 購(gòu)自朝陽(yáng)市食用菌研究所；斜面培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基） 馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂粉20g、水1000mL，pH自然；液體培養(yǎng)基 液體PDA培養(yǎng)基；葡萄糖、瓊脂粉、濃硫酸、苯酚、無(wú)水乙醇 均為分析純或化學(xué)純。

PL203電子精密天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DNP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；無(wú)菌操作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；UV-2000紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 尤尼柯（上海）儀器有限公司；THZ-C-1恒低溫氣浴搖床 上海豐盟科技材料有限公司；HH-S水浴鍋 鞏義市英峪儀器一廠；MLS-3750高壓滅菌鍋 日本三洋；TDZ5-WS離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化 將保存菌種用接種針接入斜面培養(yǎng)基中，25℃恒溫培養(yǎng)7d。

1.2.2 菌絲體液體種子培養(yǎng) 在PDA液體培養(yǎng)基中接入斜面菌體，培養(yǎng)溫度28℃，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，培養(yǎng)5～7d。

1.2.3 菌絲體液體發(fā)酵 將種子液按10%接種量接入PDA液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度28℃，150r/min搖床培養(yǎng)5～7d。將發(fā)酵液過(guò)濾獲得菌絲體，用蒸餾水洗滌2次，60℃烘干后粉碎過(guò)60目篩子，備用。

1.2.4 多糖提取實(shí)驗(yàn)方法 稱取上述杏鮑菇菌絲體干粉，加適量蒸餾水，在一定溫度下水浴浸提一定時(shí)間，過(guò)濾，濾液適當(dāng)濃縮，加適量乙醇，混勻，置4℃冰箱中過(guò)夜，取出后4000r/min離心20min，棄去上清液，所得沉淀用乙醇反復(fù)洗滌3次，60℃烘干，得粗多糖，測(cè)定粗多糖中多糖含量。

采用響應(yīng)面法優(yōu)化多糖提取工藝，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 The factors and levels of respond surface analysis

1.2.5 多糖的測(cè)定 采用苯酚-硫酸法[6]。

多糖得率（%）=多糖含量/菌體干重×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 杏鮑菇菌絲體多糖提取單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 液固比的確定 從多糖得率與液固比的關(guān)系圖（圖1）中可以看出，隨著液固比的不斷增加，浸提出的多糖量逐漸增加，多糖得率也顯著增加，但當(dāng)液固比達(dá)20∶1（mL/g）之后，大部分多糖已被浸提出來(lái)，再增加浸提液體積，多糖得率增長(zhǎng)緩慢，從經(jīng)濟(jì)和操作體積方面考慮，選擇液固比在10∶1～30∶1（mL/g）為宜。

圖1 液固比對(duì)多糖得率的影響Fig.1 The effect of liquid to solid ratio on the polysaccharide yield

2.1.2 浸提溫度的確定 從多糖得率與浸提時(shí)間的關(guān)系圖（圖2）中可以看出，隨著浸提溫度的不斷提高，多糖得率也顯著增加，但當(dāng)浸提溫度達(dá)90℃以上后，多糖得率增長(zhǎng)緩慢，由于在常壓下浸提易于操作，如溫度超過(guò)100℃，還需進(jìn)行加壓，故選擇浸提溫度在80～100℃之間。

圖2 浸提溫度對(duì)多糖得率的影響Fig.2 Theeffectofextractiontemperatureonpolysaccharideyield

2.1.3 浸提時(shí)間的確定 從多糖得率與浸提時(shí)間的關(guān)系圖（圖3）中可以看出，隨著浸提時(shí)間的不斷增加，多糖得率也顯著加大，但當(dāng)浸提時(shí)間超過(guò)2h后，由于大部分多糖已被浸提出來(lái)，多糖得率增長(zhǎng)緩慢，故選擇浸提時(shí)間在1～3h。

圖3 浸提時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Fig.3 The effect of extraction time on polysaccharide yield

2.1.4 乙醇用量的確定 從多糖得率與乙醇用量的關(guān)系圖（圖4）中可以看出，隨著乙醇用量的不斷增加，浸提出的多糖量逐漸增加，多糖得率也顯著加大，但當(dāng)乙醇用量是浸提液的2倍后，多糖得率增長(zhǎng)緩慢，故選擇乙醇用量是浸提液的1～3倍。

圖4 乙醇用量對(duì)多糖得率的影響Fig.4 The effect of the volume of ethanol on polysaccharide yield

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化杏鮑菇菌絲體多糖提取工藝實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)液固比、浸提溫度、浸提時(shí)間、乙醇用量4個(gè)單因素實(shí)驗(yàn)所確定的水平范圍，以多糖得率為響應(yīng)值，采用Disign-Expert軟件中的Box-Behnken Design（BBD）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法設(shè)計(jì)了4因素3水平共29個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。表2為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)表。

為了處理數(shù)據(jù)的方便，各因素水平化為函數(shù)。水平變換公式如下：

液固比：A=（a-20）/10

浸提溫度：B=（b-90）/10

浸提時(shí)間：C=c-2

乙醇用量：D=d-2

a、b、c、d均為實(shí)際水平，A、B、C、D則為參與分析的邏輯水平。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表和實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 The experimental design and results of RSM

表3 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)回歸模型系數(shù)表Table 3 The regression coefficients of polynomial model

圖5 各因素交互作用對(duì)多糖得率的影響Fig.5 The effect of experimental factors interaction on polysaccharides extraction

Y=8.07+0.76A+0.40B+0.44C+1.09D-0.21AB-0.22AC-0.24AD-0.038BC-0.17BD-0.24CD-0.33A2-0.13B2-0.45C2-0.94D2

由表4方差分析得知，回歸模型的F-檢驗(yàn)極顯著（P≤0.01），說(shuō)明所擬合的二次回歸方程合適?；貧w方程的A（液固比）、B（浸提溫度）、C（浸提時(shí)間）、D（乙醇用量）、A2、C2、D2對(duì)多糖得率的影響顯著（P≤0.01）。根據(jù)回歸方程，做出響應(yīng)面圖（圖5），直觀地反映了各因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響。圖5所擬合的響應(yīng)曲面的形狀，拋物面開(kāi)口向下，說(shuō)明所擬合的回歸模型有極大值點(diǎn)。從上述回歸模型中求得最優(yōu)條件列于表5。

表4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析表Table 4 The variance analysis of experimental results

表5 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)最優(yōu)條件Table 5 The predict optimal conditions using response surface experiment

預(yù)測(cè)多糖得率最大值8.66%。由表6可見(jiàn)實(shí)際與預(yù)測(cè)的多糖得率較為接近。

3 結(jié)論

杏鮑菇是近年來(lái)開(kāi)發(fā)的食用和藥用價(jià)值都很高的珍稀食用菌，但其子實(shí)體生產(chǎn)周期長(zhǎng)、產(chǎn)率低、價(jià)格高，如從子實(shí)體中提取多糖物質(zhì)，成本較高，從而影響杏鮑菇多糖的開(kāi)發(fā)生產(chǎn)，而利用液體深層發(fā)酵生產(chǎn)真菌多糖活性物質(zhì)，具有生產(chǎn)周期短、生長(zhǎng)條件易控制、產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)。研究杏鮑菇菌絲體多糖的發(fā)酵和提取，可為深入開(kāi)發(fā)利用這一珍稀食（藥）用菌資源提供參考。本文首先通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，確定了杏鮑菇菌絲體多糖提取參數(shù)的適宜水平范圍，然后，采用響應(yīng)面法對(duì)杏鮑菇菌絲體胞內(nèi)多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。獲得杏鮑菇菌絲體多糖提取的最佳工藝參數(shù)為：液固比30∶1、浸提溫度97℃、浸提時(shí)間1.8h、乙醇用量是浸提液的2.5倍，提取1次，在該工藝條件下杏鮑菇菌絲體多糖得率達(dá)8.65%。

表6 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)最佳工藝條件的驗(yàn)證Table 6 The validation experiments for optimum technological conditions

[1]熊彪，曹洋.硒對(duì)杏鮑菇菌絲生長(zhǎng)的影響[J].食品工業(yè)科技，2008，29（2）：164-166.

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[3]顏明娟，江枝和，蔡順香.杏鮑菇營(yíng)養(yǎng)成分的分析[J].食用菌，2002（2）：11-12.

[4]盛偉，方曉陽(yáng).杏鮑菇菌絲體胞內(nèi)與胞外多糖體外抗氧化活性研究[J].中國(guó)林副特產(chǎn)，2009（1）：7-10.

[5]金周雨，李艷麗，王雪.杏鮑菇菌絲體水溶性多糖提取及培養(yǎng)條件優(yōu)化[J].菌物研究，2009，7（2）：109-112.

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Optimization of extraction conditions of polysaccharides from Pleurotus eryngii mycelium using response surface methodology

GANG Jie，LIU Bing
（College of Life Sciences，Dalian Nationalities University，Dalian 116600，China）

The extraction conditions for Pleurotus eryngii mycelial polysaccharide were optimized using response surface methodology（RSM）.On the basis of single factor experiments，the yield of polysaccharide as response value，the test parameter level range was determined.The results showed that the factors of liquid to solid ratio，extraction temperature，extraction time and volume of ethanol significant effect on the yield of polysaccharides.The optimal parameters of polysaccharides extraction from Pleurotus eryngii mycelium were as follows：the ratio of liquid to solid 30∶1（mL/g），extraction temperature 97℃，extraction time 1.8h，the volume of ethanol to extraction liquid 2.5 times，extraction once，and under the optimal conditions，the yield of Pleurotus eryngii mycelium polysaccharide extraction reached 8.65%.

Pleurotus eryngii；mycelium；polysaccharides；extraction；response surface methodology

TS201.1

B

1002-0306（2012）09-0256-04

2011－07－28

冮潔（1965-），女，博士，教授，研究方向：食品生物技術(shù)。

財(cái)政專項(xiàng)-中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)資助項(xiàng)目（DC10020106）。