馮丹琴，黃 波，劉 靜，李 靜，章海斌，肖 蕓，熊火梅，陳希敏，王小中

(1、南昌大學第二附屬醫(yī)院檢驗科，江西 南昌 330006；2、南昌大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，江西 南昌 330006)

ABL酪氨酸激酶抑制劑如伊馬替尼、達沙替尼、尼羅替尼是BCR-ABL1激酶誘導的慢性粒細胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)慢性期的一線治療藥物。酪氨酸激酶抑制劑可以大量減少白血病細胞，但卻無法清除白血病干細胞。所以，一些患者用酪氨酸激酶抑制劑治療后產(chǎn)生耐藥性[1]。對于酪氨酸激酶抑制劑耐藥的CML患者來說，異體基因造血干細胞移植是首選的治療方法。在造血干細胞移植之前用酪氨酸酶抑制劑對病人進行治療，能為移植創(chuàng)造良好狀態(tài)[2-3]。然而，造血干細胞移植誘發(fā)移植物抗宿主病已見報道[4-5]，為了減少移植排斥反應，可以用患者自身的BMSCs支持造血干細胞的造血作用。本實驗進行了CML患者BMSCs的分離培養(yǎng)及成脂分化，為后續(xù)研究提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 肝素化骨髓來源于南昌大學第二附屬醫(yī)院和第一附屬醫(yī)院血液科CML患者，F(xiàn)icoll分離液(1.077g/ml)(Solarbio)，低糖 DMEM(L-DMEM)培養(yǎng)基(Hyclone)，胎牛血清 FBS(Hyclone)，青鏈霉素混合液(Solarbio)，胰蛋白酶-EDTA消化液0.25%(Solarbio)，地塞米松(Sigma)，1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤 IBMX(Sigma)，吲哚美辛(Sigma)，牛胰島素(上海第一生化藥業(yè))，油紅O染料(Sigma)，4%多聚甲醛(碧云天生物公司)，分析純異丙醇都是商品化試劑。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs的分離、培養(yǎng) 在10ml玻璃離心管中加入2ml Ficoll分離液，再將2ml肝素化骨髓緩慢加至Ficoll分離液表面。2000r/min離心20min，用微量移液器小心吸出分界面的白膜層，PBS清洗1遍，用L-DMEM培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清，100IU/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素)重懸，以 1×106密度接種于塑料培養(yǎng)瓶中，放入37℃ 、5%CO2、飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。3d后全量換液，以后每隔2d全量換液。待貼壁細胞密度達到60%后用胰酶消化傳代。

1.2.2 BMSCs的成脂分化 第二代BMSCs密度達到60%～70%后，用胰酶消化，以密度1×105個細胞接種到35mm培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)6d后，待細胞密度達到50%～60%，加入誘導液 (L-DMEM培養(yǎng)基含有10%胎牛血清、100IU/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、地塞米松1μmol/L、1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤0.5mmol/L、吲哚美辛 50μmol/L、牛胰島素 5mg/L)。每隔2d用誘導液全量換液。

1.2.3 油紅O染色 油紅O染料工作液的配制：油紅O染料粉用異丙醇完全溶解，成為油紅O染料的儲存液。將儲存液和三蒸水按3:2比例稀釋后過濾，配制成油紅O染料的工作液(要求工作液配制完成后，20min內用完)。成脂誘導培養(yǎng)3周后，去掉培養(yǎng)皿中的細胞培養(yǎng)基，加入4%多聚甲醛2ml進行預固定，5min后去除，再加等量的新鮮4%多聚甲醛，固定60min，去除多聚甲醛。用PBS清洗1遍，待細胞培養(yǎng)皿完全干后再加油紅O染料工作液2ml染35min，去除油紅O染料工作液，用三蒸水洗2遍，在倒置顯微鏡下觀察結果。

2 結果

2.1 BMCSs的分離、培養(yǎng) Ficoll分離液(1.077g/ml)分離得到的單個核細胞3 d后貼壁，倒置顯微鏡下觀察到，細胞呈細而長的梭形或多角形，12d后細胞密度達到60%。細胞傳代后，3d可貼壁，10d后細胞密度達到60%～70%，見圖1。

圖1 分離培養(yǎng)第二代BMCSs的形態(tài)(第10d，×400)

2.2 BMSCs的成脂分化 加入誘導液48h就有少量的細胞出現(xiàn)折光性強、少而小的脂肪滴，到第8d細胞內脂肪滴明顯增多、脂肪滴體積也逐漸增大，見圖2。第21d有80%的細胞都分化為脂肪細胞，細胞外形變?yōu)閳A形或橢圓形，脂肪滴大而多、折光性強，見圖3。

圖2 第三代BMCSs成脂誘導后形態(tài)(第8d，×400)

圖3 第三代BMCSs成脂誘導后形態(tài)(第21d，×400)

2.3 油紅O染料 油紅O染色后，細胞內的脂肪滴染成紅色，見圖4。

圖4 第三代BMCSs成脂誘導后油紅染色形態(tài)(第21d，×400)

3 討論

BMSCs具有自我更新及多向分化的潛能，在一定條件下能誘導分化成骨、軟骨、骨骼肌、肌腱、韌帶、真皮和脂肪[6]。本實驗用地塞米松、牛胰島素、吲哚美辛、1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤成功誘導了慢性粒細胞白血病患者的BMSCs向脂肪細胞分化。表明，本實驗分離的慢性粒細胞白血病患者的BMSCs具有較強的分化能力，狀態(tài)良好。Ito等[7]證明人BMSCs只有在地塞米松、牛胰島素、吲哚美辛、1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤同時存在的情況下才能分化為脂肪細胞，其中任何一種藥物單獨作用都無法成功誘導成脂分化。這其中的藥理作用機制至今仍未完全闡明。

CML是多能造血干細胞惡性增生性疾病，其特征是具有費城染色體和融合的BCR-ABL基因。對于ABL酪氨酸激酶抑制劑耐藥CML患者，同種異體基因骨髓移植是首選的治療方法[2]。然而骨髓移植存在移植物抗宿主反應，容易導致移植失敗。Lazarus[8-9]和 Jootar[10]研究表明，BMSCs 能強烈而直接地抑制T淋巴細胞的增生。因BMSCs具有抑制免疫反應的特性，能有效減少移植物抗宿主的反應疾病，所以，在骨髓移植中起到重要的作用。Lazarus[8-9]研究結果顯示，惡性疾病患者的BMSCs在體外擴增后，能通過靜脈安全有效地輸入患者自身體內，并且顯著減少了急性和慢性的移植物抗宿主反應。BMSCs不僅具有抑制免疫反應的特性，而且是骨髓微環(huán)境的重要組成部分，能夠支持造血干細胞的造血作用。Koc[11]和Noort[12]研究表明BMSCs能分泌大量的細胞因子 (包括IL-6、IL-7、IL-8、IL-11，F(xiàn)lt-3 ligand,和 SCF 等)支持骨髓造血干細胞的造血作用，促進造血干細胞的移植。另外，Zhao等[13]研究顯示CML患者的BMSCs并不存在費城染色體，也不表達BCR-ABL融合基因，它們能通過分泌造血干細胞的細胞因子，支持造血細胞的生長。和同種異體的BMSCs相比，病人自身的BMSCs是理想的干細胞資源。CML患者自身的BMSCs的移植不僅能減少移植物抗宿主的反應疾病，而且能促進造血功能的恢復，所以BMSCs運用于CML的治療具有廣泛前景。CML患者急變時骨髓標本比較難抽取，考慮到標本的寶貴，本次實驗采用2ml的骨髓標本。CML患者骨髓中的白細胞數(shù)比較高，但實際分離培養(yǎng)BMSCs時，BMSCs不容易貼壁生長。細胞首先在培養(yǎng)瓶中散在聚集貼壁生長，呈細長梭形或多角形。在等待散在聚集的BMSCs融合時，發(fā)現(xiàn)它們很難完全融合，時間長了容易老化或成骨分化。Zhang等[14]研究發(fā)現(xiàn)BMSCs和CML細胞共培養(yǎng)時，BMSCs能通過分泌大量的α-干擾素抑制CML細胞的生長。由此我們推測，當CML細胞瘋狂生長的同時，是否反向抑制著BMSCs的生長？這還有待于進一步的驗證。本實驗室建立的慢性粒細胞白血病患者骨髓間充質干細胞的培養(yǎng)方法為我們后續(xù)的實驗研究打下了良好基礎。

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