陳相彪，楊偉明，陸 婧,王春林,唐 聃,賀新媛,駱禮波,石 磊

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 甲狀腺乳腺外科，貴州 遵義 563099)

·技術(shù)與方法·

研磨法和組織分離器制備乳腺癌腋窩淋巴結(jié)單細胞懸液的比較

陳相彪，楊偉明，陸 婧,王春林,唐 聃,賀新媛,駱禮波,石 磊

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 甲狀腺乳腺外科，貴州 遵義 563099)

目的比較研磨法和Gentle MACS組織分離器制備乳腺癌患者腋窩淋巴結(jié)單細胞懸液在活細胞率、絲狀物及細胞團塊方面的優(yōu)缺點，為淋巴組織細胞培養(yǎng)和流式分析找到一種更為可靠的方法。方法分別用研磨法和Gentle MACS組織分離器制備單細胞懸液，臺盼蘭染色后計數(shù)活細胞、死細胞、細胞團塊和絲狀物，并比較兩種方法的優(yōu)缺。結(jié)果兩種方法制備的腋窩淋巴組織單細胞懸液在細胞存活率方面有顯著性差異(P<0.05)。在絲狀物和細胞團塊方面，組織分離器法絲狀物和細胞團塊數(shù)量更少(P<0.05)。結(jié)論制備淋巴組織單細胞懸液，組織分離器法較研磨法更為優(yōu)異。

乳腺癌；淋巴組織 ；單細胞懸液

乳腺疾病是婦女的常見病和多發(fā)病，研究表明：乳腺疾病的患病率高達38.94%【1】。乳腺癌是婦女常見惡性腫瘤。我國乳腺癌發(fā)病率一直高居不下。乳腺癌研究一直是醫(yī)學(xué)界研究熱點。乳腺癌淋巴轉(zhuǎn)移一直是乳腺癌轉(zhuǎn)移途徑重要組成部分。研究乳腺癌淋巴轉(zhuǎn)移常需要制備乳腺癌淋巴組織單細胞懸液。近年來，F(xiàn)CM越來越多應(yīng)用于臨床檢測和科研實驗【2】。乳腺癌腋窩淋巴組織單細胞懸液制備是研究乳腺癌先決條件。有關(guān)乳腺癌腋窩淋巴組織流式細胞術(shù)單細胞懸液的制備的研究顯得尤為重要。

流式細胞術(shù)標本制備是FCM檢測能否成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。單細胞懸液制備有機械法、機械-化學(xué)法、機械-酶消化法、單細胞懸液制備儀【2】。機械法主要是利用研磨法、網(wǎng)搓法和剪碎法。由于乳腺癌腋窩淋巴組織自身的特點以及各種制備方法自身優(yōu)缺點，研磨法對于較脆的組織(如脾臟)和淋巴結(jié)常會獲得較滿意的效果。近年來，組織分離器越來越多的應(yīng)用于各種組織單細胞懸液的制備。本文就這一問題展開討論，將研磨法和組織分離器制備單細胞懸液的方法做一比較，客觀的研究兩種方法的優(yōu)缺點，探尋一種較為可靠的淋巴結(jié)單細胞懸液的制備方法。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 離心機、 OLMPUS顯微、鏡細胞濾網(wǎng)(70um篩孔) 、移液器(10μl)、24孔細胞培養(yǎng)板、離心管、載玻片、研磨器、Gentle MACS組織分離器及C管電子天平。

1.2 主要實驗試劑 RPMI1640培養(yǎng)基、臺盼蘭染液、雙蒸水、PBS。

1.3 實驗方法

1.3.1 制備臺盼蘭染液 4%臺盼藍母液的配制：取4g臺盼藍，加少量蒸餾水進行研磨，加雙蒸水至100 mL，用濾紙過濾，4℃保存，使用時用PBS稀釋至0.4% 。

1.3.2 每份標本分為相同重量兩份，隨機分配到A組和B組。

1.3.3 A組，標本剪碎至2～4mm大小碎片，置入gentle MACS C管中，按比例加RPMI1640培養(yǎng)基。Gentle MACS組織分離器上按操作說明制備單細胞懸液。B組，眼科剪將組織剪成碎片，放入研磨器內(nèi)，加入適量的PBS，緩慢轉(zhuǎn)動研磨棒，研磨至勻漿，PBS沖洗研磨器，收集所得懸液。

1.3.4 濾網(wǎng)過濾，離心(1000rpm)10 min，棄上清，吹打混勻并配成10 mL液體。再次吹打混勻。

1.3.5 移液器取同量細胞放在24孔細胞培養(yǎng)板上臺盼蘭染色3～5 min。

1.3.6 OLMPUS顯微鏡觀察細胞并拍照。鏡下觀察，死細胞被染成明顯的藍色，而活細胞拒染呈無色透明狀。

1.3.7 計數(shù)細胞并統(tǒng)計細胞活力、細胞團塊、絲狀物數(shù)：活細胞率(%)= 活細胞總數(shù)/(活細胞總數(shù)+死細胞總數(shù))×100%。

1.3.8 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)處理均采用(表1、表2、表3)SPSS17.0統(tǒng)計軟件包進行。半定量資料兩組間比較采用秩和檢驗，檢驗水準為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 1例乳腺癌腋窩淋巴節(jié)單細胞懸液計數(shù)結(jié)果(見圖1，2)

①Gentle MACS組織分離器法制備結(jié)果：

注：活細胞數(shù)：60個，死細胞數(shù)：52個，絲狀物：1個，細胞團塊：0個，活細胞率：0.536(Trypan Blue ×200)。圖1 Gentle MAcs組織分離法制備單細胞懸液鏡下觀察結(jié)果

② 研磨法制備結(jié)果：

注：活細胞數(shù)：31個，死細胞數(shù)：123個，絲狀物：3個，細胞團塊：2個，活細胞率：0.201(Trypan Blue ×200)。圖2 研磨法制備單細胞懸液鏡下觀察結(jié)果

2.2 兩種方法制備單細胞懸液活細胞率、絲狀物、細胞團塊結(jié)果(見表1，2，3)

注：與研磨組相比P<0.05。

表2 兩種方法制備單細胞懸液絲狀物情況

注：與研磨組相比P<0.05。

表3 兩種方法制備單細胞懸液細胞團塊情況

注：與研磨組相比P<0.05。

3 討論

單細胞懸液在許多方面具有廣泛用途：如腫瘤病理、腫瘤分子生物學(xué)行為等【3】。腫瘤細胞原代培養(yǎng)、腫瘤藥敏實驗、腫瘤浸潤性淋巴細胞分離也需要制備腫瘤組織的單細胞懸液【4】。實體組織單細胞懸液制備方法主要有機械法和酶消化法【6】。機械法主要是利用研磨法、網(wǎng)搓法和剪碎法。酶消化法常用的酶有：胰蛋白酶和膠原酶。胰蛋白酶對軟組織消化效果較好，膠原酶適合消化含纖維成分較多的組織【4】。酶消化法受酶的種類、濃度、消化時間的影響對細胞的活性和細胞表面受體影響較大【5】。近年來，組織分離器越來越多的應(yīng)用于各種組織單細胞懸液的制備。有研究表明：Medimachine系統(tǒng)可以在短時間內(nèi)完成實體組織單細胞懸液的制備，樣本可以完全達到流式檢測的要求【7】。

流式細胞術(shù)越來越多應(yīng)用于臨床和科研。它作為一種可在單細胞水平上對大量細胞進行快速、準確、多參數(shù)定量分析和分選的高技術(shù)，在細胞生物學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)等方面的應(yīng)用日趨廣泛和深入【7】。對于實體組織而言，獲得數(shù)量高、活性好、碎片少的單細胞懸液是進行流式分析的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和前提。實體組織單細胞懸液制備，目前無通用方法【8】。需要針對不同組織或不同的實驗?zāi)康倪x擇合適的制備方法。對于淋巴組織而言，由于淋巴組織含膠原蛋白較少，無論用研磨法還是用組織分離器法，都可以獲得足夠數(shù)量單細胞。研磨法制備腋窩淋巴組織單細胞懸液,絲狀物和細胞團塊較多。利用離心、抽提、過濾等實驗方法都難以將絲狀物分離出去。比較而言，利用Gentle MACS組織分離器制備單細胞懸液有以下優(yōu)點：①操作簡單：只需將取到的新鮮組織標本剪碎后放置到C管里面，并按操作說明安放到組織分離器上面即可。②使標本的制備過程標準化，減少人為因素對實驗過程影響。③制備單細胞懸液質(zhì)量較高，活細胞率較高，絲狀物和細胞團塊的數(shù)量較少，便于后續(xù)細胞培養(yǎng)和流式分析。④單細胞懸液的制備過程在密閉的系統(tǒng)中進行，便于無菌操作，可以大大降低細胞的污染，為后續(xù)的細胞培養(yǎng)提供無菌保障。

然而，利用Gentle MACS組織分離器制備單細胞懸液也有其不足之處：該設(shè)備造價較高，普遍應(yīng)用和推廣會受到一定限制。

【1】 譚紅輝，楊偉明，王超宇,等.匯川區(qū)5000例婦女乳腺疾病普查報告【J】.中國婦幼保健，2012,27(14):1310-1311.

【2】 張金梅，余小平，朱小爽,等.流式細胞術(shù)實體瘤組織標本制備的研究【J】.中國優(yōu)生與遺傳雜志，2000，8(6)：31.

【3】 董敬朋，陳藝華，張素娟.新鮮腫瘤組織單細胞懸液的制備方法【J】.臨床與實驗病理學(xué)雜志，1995,11(4):280.

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【8】 夏安周，邢淑華，朱學(xué)文，等.腎組織單細胞懸液制備方法的比較【J】.徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2004,24(1):49-50.

Comparisonofgrindingmethodandtissueseparatorinthepreparationforthesinglecellsuspensionsofbreastcanceraxillarylymphnodes

Chenxiangbiao,Yangweiming,Lujing,Wangchunlin,Tangdan,Hexinyuan,Luolibo,Shilei

(Department of Thyroid-breast surgery,the Affiliated Hospital of Zunyi Medical College,Guizhou Zunyi 563099,China)

ObjectiveTo compare the grinding method and Gentle MACS tissue separator in the preparation for the single cell suspensions of axillary lymph nodes in breast cancer and further find a more reliable method for cell culture and flow cytometric analysis of lymphoid tissues.MethodsThe single cell suspensions were prepared using the grinding method and Gentle MACS tissue separator.The numbers of living cells,dead cells,cell clumps and filaments were counted through trypan blue staining to further investigate the advantages and disadvantages of these two methods.ResultsNo significant difference of cell viability between grinding method and Gentle MACS tissue separator was shown.However,compared with the grinding method,fewer filaments and cell clumps were discerned via Gentle MACS tissue separator.ConclusionTissue separator might be better than grinding method in the preparation for lymph node single cell suspensions.

breast cancer;lymph node;single cell suspension

貴州省教育廳重點項目(NO:黔教科(2009)0110)。

楊偉明，男，教授，研究方向：甲狀腺、乳腺和大腸腫瘤，E-mail:yangweiming2004@126.com。

R737.9

B

1000-2715(2012)05-0435-03

【收稿2012-06-12；修回2012-08-28】

(編輯：王福軍)