郭瑞珍，王海青，胡成久，邊 可

(遵義醫(yī)學院珠海校區(qū) 病理學教研室，廣東 珠海 519041)

·臨床醫(yī)學研究·

Ras基因蛋白的表達及基因突變與皮膚病理性瘢痕和瘢痕癌的相關性

郭瑞珍，王海青，胡成久，邊 可

(遵義醫(yī)學院珠海校區(qū) 病理學教研室，廣東 珠海 519041)

目的探討Ras基因家族(K-ras、H-ras、N-ras)蛋白的表達和基因突變與病理性瘢痕上皮癌變和瘢痕癌發(fā)生的相關性。方法用激光掃描共聚焦顯微技術檢測皮膚病理性瘢痕和瘢痕癌組織中K-ras、H-ras、N-ras免疫熒光蛋白表達；免疫組織化學技術(SP)法檢測正常皮膚、病理性瘢痕和瘢痕癌組織中K-ras、H-ras、N-ras蛋白的表達；從病理性瘢痕和瘢痕癌組織中提取DNA，分析K-ras、H-ras、N-ras基因第12、13 位密碼子突變情況。所有數據運用SPSS16.0軟件包進行統(tǒng)計學分析。結果①K-ras、H-ras、N-ras3種蛋白在病理性瘢痕上皮中呈現較弱熒光，為弱陽性表達，在瘢痕癌組織中呈現較強熒光，為強陽性表達。②3種蛋白在正常皮膚表皮、病理性瘢痕上皮和瘢痕癌組織中分別呈陰性或弱陽性、弱陽性或陽性和強陽性表達。瘢痕癌組表達水平(陽性面積)、表達強度(平均光密度)與正常皮膚、病理性瘢痕組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P﹤0.01；P﹤0.05)；但正常皮膚組與病理性瘢痕組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P﹥0.05)。③病理性瘢痕和瘢痕癌中均未發(fā)現K-ras、H-ras、N-ras基因12、13位密碼子突變。結論①瘢痕癌的發(fā)生與K-ras、H-ras、N-ras蛋白的高表達有相關性；②病理性瘢痕上皮和瘢痕癌組織中不存在K-ras、H-ras、N-ras基因12、13位密碼子突變。③病理性瘢痕上皮中沒有發(fā)現癌變早期信號。

病理性瘢痕；瘢痕癌；Ras基因；突變；癌變

皮膚病理性瘢痕是一種癌前病變，病理性瘢痕被覆上皮癌變而形成的癌稱之為瘢痕癌。由于至今未能成功復制病理性瘢痕和瘢痕癌的動物模型提供研究，致使目前與瘢痕癌的發(fā)生和瘢痕上皮癌變的相關性研究極少有報道。Ras基因是較早被鑒定的人類癌基因之一，其基因家族包含H-ras、N-ras、K-ras 3種功能性基因，研究認為，Ras基因的異常高表達和基因突變與多種人類惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關【1,2】，而且，Ras基因的異常高表達和基因突變，可出現在許多癌前病變中，認為可用檢測Ras癌基因的方法對癌變傾向提供較早信息【3】。本組從蛋白水平、基因突變的水平，對比分析Ras基因與瘢痕癌的發(fā)生和病理性瘢痕癌變的相關性，其研究結果及意義如下。

1 材料與方法

1.1 材料 檢測組織均為10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，HE染色，光鏡觀察確診。標本源于遵義醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院和第五附屬醫(yī)院病理科。正常皮膚取自臨床手術切除的帶有正常皮膚組織的病變標本；病理性瘢痕病例臨床有皮膚燒傷、燙傷或機械性創(chuàng)傷等損傷史，有瘢痕形成時間記載的13例，分別為5個月、3年、58年和60年各1例，10年3例，20年4例，30年2例。病變部位有胸部、大腿、小腿等處；瘢痕癌病例臨床有瘢痕形成史，有癌變時間記載的5個病例，分別于瘢痕形成后21年、18年、18年、12年和10年發(fā)生癌變。病變部位有頭面部、上肢、下肢等處。組織學類型均為鱗狀細胞癌。

1.2 主要實驗試劑

1.2.1 熒光免疫試劑 鼠抗人H-ras多克隆抗體，購自美國SANTA公司；兔抗人N-ras、K-ras多克隆抗體購自武漢博士德公司；羊抗兔FITC抗體、羊抗鼠Cy3抗體購自北京中衫金橋公司。

1.2.2 免疫組織化學試劑 兔抗人K-Ras 、H-Ras 、N-Ras多克隆抗體，購自武漢博士德公司。

1.2.3 基因突變檢測主要試劑 AxyPrep基因組DNA提取試劑盒由上海百賽公司提供； PCR反應試劑盒由北京天根公司提供；引物設計和引物序列參照文獻進行【4】，由上海生物工程公司合成。

表1 H-ras、 N-ras 和K-ras基因第12、13位密碼子引物序列及擴增片段

1.3 實驗方法及步驟

1.3.1 組織切片 福爾馬林固定，石蠟包埋標本，連續(xù)切片4張(4μm厚)，撈片于防脫片上，60℃烤干，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 激光掃描共聚焦顯微技術 抗體搭配及要求:免疫熒光雙標染色，所用一抗有K-Ras(兔抗人)、H-Ras(鼠抗人)、N-Ras(兔抗人)；二抗有Cy3(羊抗兔、波長570nm)、FITC(羊抗鼠)、波長468nm)。雙標抗體搭配 ：K-Ras(二抗：Cy3)/ H-Ras(二抗：FITC)、N-Ras(二抗：Cy3)/ H-Ras(二抗：FITC)，實驗步驟：石蠟切片常規(guī)脫臘至水，微波抗原修復；操作步驟按試劑盒說明書進行，用抗淬滅的熒光封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡掃描并合成圖片。

1.3.3 免疫組織化學技術(SP法) 用結腸癌組織切片作陽性對照，用PBS代替一抗作空白對照。切片經脫臘、流水沖洗，微波修復抗原，按試劑盒說明書進行操作，DAB顯色后，經復染、透明、封片，光鏡觀察。

1.3.4 基因突變檢測技術 對28個病例(病理性瘢痕和瘢痕癌各14例)按AxyPrep基因組DNA提取試劑盒說明書進行DNA提取；PCR擴增序列片段長度：K-ras序列為162 bp，H-ras序列為170 bp，N-ras序列為183 bp。測序：擴增產物送上海生工公司 雙向測序。

1.4 實驗結果的判斷

1.4.1 激光共聚焦顯微技術結果判定標準 免疫熒光雙標的石蠟切片，在倒置Leica熒光顯微鏡通過綠色、紅色通道可以觀察到陽性的熒光信號判斷為實驗成功，陽性熒光信號定位于細胞質或細胞膜。其中綠色熒光信號代表FITC標記的陽性信號；紅色熒光信號代表Cy3標記的陽性信號；兩種陽性熒光信號疊加呈現黃色。經激光共聚焦顯微鏡掃描并拍照，合成后獲得三維立體結構圖像。

1.4.2 免疫組織化學實驗結果判定標準 3種蛋白均以細胞質出現棕黃色顆粒為陽性細胞。采用半定量積分法，根據陽性細胞百分數和染色強度計分的乘積分為4個等級，<2分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(+)，4～6分為陽性(++)，>6分為強陽性(+++)，≥6分為高表達，<6分為低表達，<2分為陰性。運用CCD成像系統(tǒng)，每張切片隨機選取5個高倍視野，應用顯微圖像分析系統(tǒng)分別檢測陽性染色的表達水平(即陽性面積代數和與分析區(qū)域面積的比值，值越大，陽性表達水平越高)和表達強度(即平均光密度值，值越大，陽性表達強度越高)，各取平均值，最后進行統(tǒng)計學分析。

1.4.3 PCR擴增結果判斷與檢測 PCR擴增觀察到162bp的K-ras、170bp的H-ras和183bp的N-ras的單一條帶表明擴增成功。 擴增產物送上海生工公司測序，用Chromas軟件分析DNA測序圖譜，并運用Geneious軟件與其正?；蛐蛄羞M行比對，查找突變位點。

2 結果

2.1 激光掃描共聚焦顯微技術雙標記結果 在倒置Leica熒光顯微鏡下，通過綠色、紅色通道可見，FITC標記的H-Ras蛋白的陽性信號為綠色熒光； Cy3標記的K-Ras、N-Ras蛋白的陽性信號為紅色熒光；兩種熒光信號重疊部位呈黃色，陽性信號定位于細胞質和細胞膜。其中病理性瘢痕上皮中陽性熒光信號較弱，呈弱表達，瘢痕癌組織中陽性熒光信號較強，呈強表達(見圖1,圖2)。

注：A 病理性瘢痕上皮中H-ras呈現較弱綠色熒光；K-ras呈現較弱紅色熒光；共同表達的部位呈黃色熒光。B 瘢痕癌組織中H-ras 呈現較強綠色熒光；K-ras呈現較強紅色熒光；共同表達的部位呈黃色熒光。圖1 病理性瘢痕上皮和瘢痕癌組織中H-ras /K-ras雙標記免疫熒光(×400)

注：A 病理性瘢痕上皮中H-ras呈現較弱綠色熒光；N-ras呈現較弱紅色熒光；共同表達的部位呈黃色熒光。B 瘢痕癌組織中H-ras呈現較強綠色熒光；N-ras呈現較強紅色熒光；共同表達的部位呈黃色熒光。圖2 病理性瘢痕上皮和瘢痕癌組織中H-ras/N-ras雙標記免疫熒光(×400)

2.2 免疫組織化學標記結果的表達 H-ras、N-ras、K-ras 3種蛋白陽性表達信號呈棕黃色、顆粒狀，主要定位于細胞質或細胞膜。在正常皮膚表皮中呈陰性或弱陽性表達，弱陽性表達細胞數量較少，見于基底細胞層，不見于顆粒層和棘細胞層；在瘢痕上皮中呈弱陽性或陽性表達，陽性表達細胞數較正常皮膚表皮增多，見于基底細胞層、顆粒層和棘細胞層；在瘢痕癌中呈強陽性表達(見圖3～圖5)。其表達水平(陽性面積)、表達強度(平均光密度)在正常皮膚、皮膚瘢痕和瘢痕癌之間有差異(H-rasFPA=22.807，PPA﹤0.001；FOD=20.808，POD﹤0.001，)，(N-rasFPA=10.220，PPA﹤0.001；FOD=6.698，POD=0.003)，(K-rasFPA=10.295，PPA﹤0.001；FOD=3.506，POD=0.039)，瘢痕癌組分別與正常皮膚組和瘢痕組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P﹤0.01；P﹤0.05)，但正常皮膚組與瘢痕組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P﹥0.05),(見表2)。

注：A 正常皮膚表皮中呈陰性；B 病理性瘢痕上皮中呈弱陽性表達 ；C瘢痕癌組織中中呈強陽性表達。圖3 正常皮膚表皮、病理性瘢痕上皮和瘢痕癌組織中H-ras蛋白的表達(IHC ×400)

注:A 正常皮膚表皮中呈陰性表達；B在皮膚瘢痕上皮中呈弱陽性表達；C在皮膚瘢痕癌中呈強陽性表達。圖4 正常皮膚表皮、病理性瘢痕上皮和瘢痕癌組織中N-ras蛋白的表達(IHC×400)

注：A 正常皮膚表皮中呈弱陽性表達；B皮膚瘢痕上皮中呈弱陽性表達；C皮膚瘢痕癌中呈強陽性表達。圖5 正常皮膚表皮、病理性瘢痕上皮和瘢痕癌組織中K-ras蛋白的表達(IHC×400)

表2 H-ras、N-ras、K-ras蛋白在各組組織中的表達

注：PA代表陽性面積代數和/分析區(qū)域面積的比值；OD代表平均光密度。與正常皮膚和瘢痕組比，*P<0.05；**P<0.01。

2.3 基因突變檢測結果 擴增、測序結果28個樣本(病理性瘢痕和瘢痕癌各14例)均成功擴增出K-ras(162bp)、H-ras(170bp)和N-ras(183bp)的基因片段，凝膠電泳均顯示為單一條帶(見圖6)。PCR擴增產物測序均未檢測出K-ras、H-ras和N-ras基因第12、13位密碼子突變。

注：M為DNA marker；A H-ras基因，1為瘢痕，2、3、4、5、6為瘢痕癌；B N-ras基因,1、2為瘢痕，3、4、5、6、7為瘢痕癌；C K-ras基因,1、2為瘢痕，3、4、5、6為瘢痕癌。圖6 H-ras、N-ras、K-ras 基因電泳結果

2.4 瘢痕癌中3種蛋白表達的相關性 瘢痕癌中H-ras、N-ras、K-ras蛋白陽性率分別為70%、70%、85%，經相關性分析，H-ras與K-ras表達無相關性(r=0.031，P=1.000)， K-ras與N-ras表達無相關性(r=0.336，P=0.202)，H-ras與N-ras表達無相關性(r=0.286，P=0.303)。

3 討論

3.1 瘢痕癌中Ras蛋白的表達及意義 自Ras基因發(fā)現以來，其與皮膚腫瘤的研究包括有皮膚基底細胞癌、鱗狀細胞癌和黑色素瘤等，Platz 等【5】研究30例轉移性黑色素瘤，發(fā)現23例(76.7%)存在N-ras蛋白的高表達，研究者們認為Ras的高表達可能與皮膚惡性黑色素瘤的發(fā)生、發(fā)展有關。Kikuchi等【6】應用免疫組織化學方法研究了皮膚基底細胞癌、鱗狀細胞癌，發(fā)現Ras的表達與腫瘤分化程度相一致，認為Ras的表達與腫瘤的分化有相關性。Tanikawa等【7】也報道，RAS蛋白在脂溢性角化病和Bowen病中分別呈陰性和陽性表達，在惡性黑色素瘤中呈強陽性表達。本組用免疫組織化學和激光掃描共聚焦顯微技術兩種不同的方法，檢測了RAS 基因家族3種蛋白在瘢痕癌中的表達，結果顯示3種蛋白在瘢痕癌組織中均呈強陽性、高表達，其表達水平、表達強度明顯高于正常皮膚表皮和瘢痕上皮(P﹤0.05)，提示三種蛋白的高表達與瘢痕癌的發(fā)生有密切相關性。經相關性分析，H-ras、N-ras、K-ras蛋白之間兩兩比較均無相關性(P﹥0.05)，提示在瘢痕癌的形成過程中，Ras基因家族的3種蛋白可能發(fā)揮了協(xié)同作用。作用機制可能系原癌基因Ras被激活后變成有致癌活性的癌基因，通過Raf/MEK/ERK途徑促使細胞從G1期進入S期，通過PI3K/PTEN/Akt介導抗凋亡，從而促進細胞增殖和癌變，介導腫瘤的發(fā)生【4.8】。

3.2 瘢痕癌中Ras 基因的突變及意義 Ras基因點突變在人類惡性腫瘤中約占30%，K-ras、N-ras、H-ras的點突變率分別為85%、15%和﹤1%【9.10】；12、13、61位密碼子為常見的突變位點，尤以第12位密碼子突變最常見，多為GGT突變成GTT【11】。Shields等【12】報道在胰腺癌中K-ras基因第12位密碼子突變率高達95%，認為該密碼子突變是胰腺癌的早期事件，是早期基因診斷胰腺癌的有效方法。還有報道，H-ras基因第12位密碼子的突變與膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展有相關性，突變率為46.7%。K-ras基因突變與異位的子宮內膜上皮惡變可能有相關性。在人體皮膚腫瘤的研究中，Ras基因的總突變率在10～20%左右【13】，其中N-ras突變率為16%～22%，而K-ras和H-ras的突變率分別為2%、1%【14】。這些研究結果提示，人類皮膚腫瘤中Ras基因突變率比其它上皮性腫瘤突變率似乎較低。本組檢測的14例瘢痕癌組織，未發(fā)現12、13位密碼子的突變。提示 Ras基因家族蛋白的激活可能還有其它方式，或者突變于其它位點，有待進一步探討。

3.3 Ras蛋白的表達及基因突變與病理性瘢痕癌變的相關性 病理性瘢痕屬于一種癌前病變。癌前病變發(fā)生癌變的潛伏期長短難以判斷，癌變的不可預見性很大。一旦發(fā)生癌變而成為瘢痕癌，可能對患者造成嚴重的后果。如何早期發(fā)現病理性瘢痕的發(fā)展趨勢，這是一個值得重視和探索的問題。近年來，皮膚腫瘤的發(fā)生率有逐年上升趨勢，這其中不排除某些皮膚腫瘤的發(fā)生是從癌前病變開始慢慢演化而成的。Braut等【15】認為，Ras基因的異常表達是癌變過程中較早出現的分子改變，與腫瘤的啟動及癌變程度密切相關，對癌癥的早期發(fā)現具有重要意義。Nindl【16】等報道在光化性角化病(AK)中有H-ras和P53基因突變，Zaravinos【17】等在同樣的病變中發(fā)現有H-ras的12位密碼子第2堿基G>T置換。研究者認為在非腫瘤性病變進展惡變的過程中，基因突變可能是一個早期事件。本組采用兩種不同的檢測手段，均顯示3中蛋白在病理性瘢痕上皮組織中呈現低表達，其表達水平、表達強度明顯低于瘢痕癌，與正常皮膚表皮比較沒有統(tǒng)計學意義，提示在本組研究的病理性瘢痕組織中沒有Ras基因三種蛋白的異常表達。同樣，對14例瘢痕組織進行基因突變檢測，沒有發(fā)現12、13位密碼子有突變。

綜上所述，本研究結果認為：Ras基因家族中的3種蛋白在瘢痕癌中呈現高表達，與瘢痕癌的發(fā)生有相關性；在病理性瘢痕和瘢痕癌中未發(fā)現12、13位密碼子突變；病理性瘢痕上皮中3種蛋白的表達與正常皮膚表皮的表達沒有統(tǒng)計學意義。后兩個結果均提示，病理性瘢痕上皮中沒有癌變早期信號，這不同于他人的研究，這與受檢標本量有關？與RAS基因在不同來源腫瘤組織中的激活形式和突變位點有特異性？還是瘢痕和瘢痕癌中可能根本不存在基因突變？這些都留給我們更多的思考，有待進一步深入探討。

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CorrelationofRasgeneproteinexpressionandgenemutationandskinpathologicalscarandscarcarcinoma

Guoruizhen,Wanghaiqing,Huchengjiu,Bianke

(Department of Pathology,the Zhuhai Campus of Zunyi Medical College,Guangdong Zhuhai 519041,China)

ObjectiveTo investigate the correlation of Ras family (H-ras/N-ras/K-ras) protein expression and gene mutation between the canceration of skin pathological scar and the occurrence of scar carcinoma abuote.MethodsConfocal microscopy was used to detect the protein expression of K-ras,H-ras and N-ras in skin pathological scars and scar carcinoma tissues.K-ras,H-ras and N-ras expressions in normal skin tissue,pathological scar and scar carcinoma were measured by the immunohistochemical staining of SP method.DNA in skin pathological scar and scar carcinoma tissues was extracted and H-ras,N-ras and K-ras mutations in codons 12 and 13 were analyzed using PCR and sequencing.ResultsThe fluorescence expression of K-ras,H-ras and N-ras in scar carcinoma was higher than those in pathological scar epithelium via confocal microscopy assay.K-ras,H-ras and N-ras protin expression in normal skin tissue,pathological scar epithelium and scar carcinoma was gradually increased.Furthermore,there was significant difference of protein expression level including protein-positive area and the mean optical density between normal skin and scar carcinoma groups (P<0.05).However,no significant difference was shown between normal and skin pathological scar groups (P>0.05).In addition,the mutations of codons 12 and 13 of H-ras,N-ras and K-ras genes were not detected in skin pathological scar and scar carcinoma.Conclusion①The higher expression of K-ras,H-ras and N-ras might play an important role in the occurrence of skin scar carcinoma.②No mutations of codons 12 and 13 of H-ras,N-ras and K-ras genes were found in skin pathological scar and scar carcinoma.③Early canceration signal was not discerned in the pathological scar epithelium.

pathological scar;scar carcinoma;Ras gene;mutation;canceration

遵義醫(yī)學院自然科學類招標項目(NO:F-552)；貴州省科技攻關項目(NO:2010-3080)。

R739.5

A

1000-2715(2012)05-0389-07

【收稿2012-06-27；修回2012-09-03】

(編輯：譚秀榮)