肖 苑，李文娜，黃燮南，陳 陽(yáng)

(遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)，廣東 珠海 519041)

遵義杜仲葉綠原酸提取工藝的優(yōu)化研究

肖 苑，李文娜，黃燮南，陳 陽(yáng)

(遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)，廣東 珠海 519041)

目的優(yōu)化杜仲葉中綠原酸的提取工藝。方法以綠原酸提取率為指標(biāo)，通過(guò)單因素和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選提取方法與工藝參數(shù)。結(jié)果當(dāng)乙醇濃度為60%、料液比為1∶12、pH=5、提取時(shí)間為30 min時(shí)，在超聲頻率25kHz的條件下提取2次，綠原酸的得率為2.54%,較用其他各組參數(shù)提取的得率高。結(jié)論杜仲葉中綠原酸的最佳超聲提取工藝為：以60%乙醇為溶劑、料液比為1∶12、pH=5，提取時(shí)間30 min。

杜仲葉；綠原酸；提取工藝

杜仲(EucommiaulmoidesOliv.)是我國(guó)常用的中藥材之一，對(duì)杜仲的深入研究具有廣泛的應(yīng)用前景。已知杜仲葉與杜仲皮的化學(xué)成分，特別是藥效成分基本一致【1】。因杜仲葉適當(dāng)采收后可再發(fā)新葉，就實(shí)現(xiàn)資源的可循環(huán)利用而言，對(duì)杜仲葉中藥物成分的研究、優(yōu)化提取工藝、提高有效成分得率，具有十分重要的實(shí)際意義。綠原酸(chlorogenic acid)是杜仲葉中苯丙素類化合物的主要有效成分之一，具有抗氧化、保護(hù)心血管、抑制突變、抗菌抗病毒及抗腫瘤等作用【2】。為提高其開(kāi)發(fā)利用價(jià)值，本文以貴州遵義產(chǎn)杜仲葉為原料，采用正交試驗(yàn)，對(duì)綠原酸的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試藥 UV-2550紫外分光檢測(cè)器(日本島津)； HS3120型超聲波清洗機(jī)(天津恒高有限公司)；HHW21-600型電熱恒溫水浴箱(北京長(zhǎng)源實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)； FZl02微型植物試樣粉碎機(jī)(黃驊市中興儀器有限公司)； PHSJ-5型數(shù)顯PH計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)； 722型可見(jiàn)分光光度計(jì)(上?，F(xiàn)科分光儀器有限公司)；杜仲葉(貴州省遵義市中藥藥材站)；綠原酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)；其他試劑均為分析純。

1.2 方法與結(jié)果

1.2.1 杜仲葉預(yù)處理和溶液配制 稱取一定量干燥粉碎的杜仲葉，按料液比2∶5加入氯仿浸泡2次，每次4 h，抽濾自然風(fēng)干備用。另取杜仲葉粗粉1.0g按本實(shí)驗(yàn)最佳提取工藝提取綠原酸，過(guò)濾，定容至50 mL，即為樣品液。精密稱取綠原酸對(duì)照品10 mg，置15 mL具塞試管中，用50%甲醇溶解，定容即得對(duì)照品溶液。

1.2.2 最大吸收波長(zhǎng)的確定【3】精密吸取50 μl對(duì)照品溶液點(diǎn)于條形層析紙上，用水-醋酸-正丁醇(5∶l∶4)混合后的上清液作展開(kāi)劑，飽和3.5 h后，上行展開(kāi)，展距為15 cm時(shí)取出，并置低溫、避光風(fēng)干。然后在紫外光分析儀下以254 nm的波長(zhǎng)觀察，可見(jiàn)在Rf值為0.70 cm處出現(xiàn)淡藍(lán)色斑點(diǎn)，剪下各熒光斑點(diǎn)，加入50%甲醇溶解定容至10 mL，超聲震蕩20 min。再在200～400 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行UV掃描，此時(shí)可在327 nm處觀察到最大吸收峰，故選擇為測(cè)定波長(zhǎng)。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密吸取5、10、15、20、25、30 μl對(duì)照品溶液，按“1.2.2”項(xiàng)下操作，用甲醇作空白對(duì)照，在波長(zhǎng)327 nm下測(cè)定吸光度(A)，以A為縱坐標(biāo)、綠原酸濃度C為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程為：A=0.0359C+0.0029(r=0.9990)，綠原酸0.5～3.0 mg·L-1范圍內(nèi)與吸光度的線性關(guān)系良好。

1.2.4 加樣回收率試驗(yàn) 在已知含量的杜仲葉粗粉中加入不同量的綠原酸對(duì)照品，按“1.2.2”項(xiàng)下操作同法測(cè)定吸光度，得綠原酸含量。其平均回收率為98.65%，RSD為1.88%，表明此法回收率較好。

1.2.5 不同提取工藝提取綠原酸對(duì)比 超聲提取法【4】：精確稱取杜仲葉干粉10g，用60%乙醇按料液比1∶8、pH=5，浸泡12 h，超聲提取2次，每次40 min，然后抽濾，濃縮濾液。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，檢測(cè)綠原酸平均得率為2.16%，RSD 0.09%。

水提取法【5】：精確稱取杜仲葉干粉10g，用雙蒸水按料液比1∶25、pH=5、溫度為65℃提取2次,每次90min，將濾液抽濾，濃縮。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，檢測(cè)綠原酸平均得率為1.57%，RSD 0.12%。

乙醇提取法【6】：精確稱取杜仲葉干粉10g，用70%乙醇按料液比1∶16在90℃水浴中回流提取2次，每次1.5 h，再抽濾并濃縮濾液。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，檢測(cè)綠原酸平均得率1.93%，RSD 0.05%。

微波提取法【7】：精確稱取杜仲葉干粉10g，在微波處理器中反復(fù)處理 3次，每次30S，再用超聲波提取30 min，接著抽濾，收集濾液。殘?jiān)?00mL水重復(fù)提取1次，抽濾，濃縮濾液。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，檢測(cè)綠原酸平均得率為1.99%，RSD 1.03%。綜上可見(jiàn)四種提取工藝中超聲提取法綠原酸得率較高，且工藝穩(wěn)定，因此本實(shí)驗(yàn)采用超聲提取法提取綠原酸。

1.2.6 單因素考察提取工藝 為觀察提取次數(shù)、乙醇濃度、料液比、超聲提取時(shí)間與溶劑pH等因素對(duì)綠原酸得率的影響，先稱取杜仲葉粗粉若干份，每份均為1.0g，進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)：

提取次數(shù)的影響：取杜仲葉粗粉5份，按料液比1∶16加入70%乙醇，在pH=5，常溫下超聲提取，5份樣本分別提取1、2、3、4、5次，每次40 min。測(cè)得的綠原酸得率分別為：1.87%，1.92%，1.92%，1.92%，1.92%。結(jié)果顯示提取2次后，綠原酸得率開(kāi)始趨于平緩。多次提取綠原酸的得率提高不明顯，而工作量、生產(chǎn)成本提高，故實(shí)驗(yàn)采用2次提取。

乙醇濃度的影響：取杜仲葉粗粉6份，按料液比1∶16加入濃度分別為20%、30%、40%、50%、60%、70%的乙醇，在pH=5，常溫下提取2次，每次40 min，經(jīng)測(cè)定濾液綠原酸含量發(fā)現(xiàn)其提取率分別為1.92%、1.95%、1.97%、2.12%、1.99%、1.92%。

料液比的影響：取杜仲葉粗粉6份，按料液比l∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14與1∶16加入50%乙醇，在pH=5，常溫下提取2次，每次40min，過(guò)濾合并提取液，測(cè)定含量。綠原酸得率分別為1.97%、2.00%、2.02%、2.09%、2.10%、2.11%。

提取時(shí)間的影響：取杜仲葉粗粉6份，按料液比1∶12加入50%乙醇，在pH=5，常溫下提取，時(shí)間分別為10、20、30、40、50、60min，各提取2次，合并濾液。測(cè)得綠原酸的提取率分別為：1.90%，2.02%，2.06%，2.07%，2.07%，2.08%。

溶劑pH的影響：先用酸調(diào)節(jié)50%乙醇的pH,使之分別為2、3、4、5、6等6種溶劑，然后按料液比為1∶12加入相應(yīng)的6份杜仲葉粗粉中，在常溫下提取2次，每次40 min，考察pH值對(duì)綠原酸得率的影響。測(cè)得綠原酸的提取率分別為：1.86%，2.08%，2.10%，2.13%，1.99%。結(jié)果顯示乙醇濃度、料液比、超聲提取時(shí)間、溶劑pH均對(duì)綠原酸提取有明顯影響。

1.2.7 正交試驗(yàn) 選取超聲提取法，頻率為25kHz.根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，提取次數(shù)為2次，將影響綠原酸提取效果的幾個(gè)主要因素即提取時(shí)間(A)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(B)、料液比(C)、提取溶劑的pH值(D),進(jìn)行正交設(shè)計(jì)，正交因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。稱取杜仲葉粗粉9份，每份1.0g，按正交表L9(34)安排正交實(shí)驗(yàn),測(cè)定綠原酸的得率(見(jiàn)表2)。結(jié)果可見(jiàn)對(duì)提取因素影響大小順序?yàn)?C>A>B>D，最佳工藝條件為 A1B3C3D2。

表1 因素水平表

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.2.8 最佳條件下的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 稱取杜仲葉粗粉1.0g在最佳條件下進(jìn)行了3批驗(yàn)證試驗(yàn)，綠原酸平均得率為2.54%，RSD 0.98%。

2 討論

本研究采用紙層析-UV分光光度法對(duì)綠原酸含量進(jìn)行測(cè)定，可有效避免杜仲葉提取物中黃酮類物質(zhì)對(duì)綠原酸的干擾而導(dǎo)致的測(cè)定結(jié)果偏差【8】。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)同等工藝條件下，四種工藝提取綠原酸的得率均低于文獻(xiàn)報(bào)道。采用不同提取法杜仲葉中綠原酸得率的文獻(xiàn)報(bào)道值如下：超聲提取為2.61%【4】、水提為1.97%【5】、乙醇(70%)提取為4%以上【6】、微波強(qiáng)化提取為3.17%【7】。而我們采用上述文獻(xiàn)相應(yīng)工藝提取綠原酸的得率分別為2.16%、1.57%、1.93%、1.99%，均低于相應(yīng)文獻(xiàn)報(bào)道。究其原因可能與杜仲葉的產(chǎn)地、采收季節(jié)、采收時(shí)的樹(shù)齡、綠原酸含量測(cè)定方法等因素有關(guān)。貴州遵義是杜仲的主產(chǎn)地之一【9】，并且當(dāng)?shù)卦现芯G原酸的含量較高【10】，目前尚且沒(méi)有成熟的提取工藝，為更合理利用這一寶貴資源，我們的研究目的在于優(yōu)化超聲提取杜仲葉中綠原酸的工藝。

考慮工業(yè)生產(chǎn)條件，本實(shí)驗(yàn)未采用加熱方法，但超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，溫度也會(huì)上升，會(huì)對(duì)綠原酸穩(wěn)定性產(chǎn)生影響，所以我們還觀察了超聲提取過(guò)程中溫度的變化。發(fā)現(xiàn)在10～60min內(nèi)，超聲提取時(shí)溶液溫度僅在30～50℃變動(dòng)，而綠原酸在此范圍內(nèi)化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，故溫度變化對(duì)綠原酸提取無(wú)影響。超聲提取時(shí)不需加熱，避免了醇提取與水提取需加熱，以及微波瞬時(shí)高溫對(duì)有效成分的不良影響，同時(shí)也節(jié)省了能源；超聲提取還具有溶劑用量少，在提取過(guò)程中不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，對(duì)綠原酸的生理活性無(wú)影響，有利于進(jìn)一步分離純化和不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)。所以本實(shí)驗(yàn)選用超聲提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并根據(jù)文獻(xiàn)選擇25kHz的頻率。單因素考察提取工藝的結(jié)果表明，提取2次綠原酸得率較高，且節(jié)約工時(shí)和成本。另?yè)?jù)單因素考察提取工藝結(jié)果，我們?cè)谝掖俭w積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間、溶劑的pH值等幾個(gè)因素中各選出3個(gè)相鄰的子因素進(jìn)行考察。選擇的原則是，以3個(gè)連續(xù)子因素所對(duì)應(yīng)的綠原酸得率最高或較高，并適當(dāng)考慮節(jié)省人力與物力。通過(guò)正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)確定，超聲(25kHz)提取法的最佳工藝條件為：用60%乙醇為溶劑，料液比1∶12， pH=5，提取時(shí)間30 min，提取2次。最佳條件下的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該提取工藝比較穩(wěn)定,重現(xiàn)性良好。

【1】 Luo J,Tian C,Xu J,Sun Y.Studies on the antioxidant activity and phenolic compounds of enzyme-assisted water extracts from Du-zhong (Eucommia ulmoides Oliv.) leaves【J】.J Enzyme Inhib Med Chem,2009,24(6):1280-1287.

【2】 蘭小艷,張學(xué)俊,龔桂珍.杜仲葉中綠原酸的研究進(jìn)展【J】.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2009,(21):86-89.

【3】 齊惠麗.杜仲葉中綠原酸提取工藝研究【D】.天津:天津大學(xué),2007.

【4】 齊惠麗,趙廣榮,李東.杜仲葉中綠原酸的超聲提取工藝研究【J】.西北藥學(xué)雜志,2007,(6):300-301.

【5】 李光鋒.杜仲葉中綠原酸的提取、純化研究【D】.長(zhǎng)沙:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué),2006.

【6】 左航,黃文,李天宏,等.杜仲葉中綠原酸的提取條件優(yōu)化及其提取物的降血脂作用【J】.林業(yè)科學(xué),2009,(1):158-160.

【7】 李劍敏,衛(wèi)兵兵,陳志紅.微波強(qiáng)化提取杜仲葉中綠原酸的工藝研究【J】.應(yīng)用化工,2006,35(4):243-245.

【8】 胡鮮寶,范貴生,呂加平.綠原酸提取純化及檢測(cè)方法的研究進(jìn)展【J】.農(nóng)產(chǎn)品加工學(xué)刊,2009,(11):85-88.

【9】 李新貴,黃小柱,林皎.遵義縣杜仲采種基地營(yíng)建技術(shù)及經(jīng)營(yíng)措施【J】.中南林業(yè)調(diào)查規(guī)劃,2009,28(2):27-30.

【10】 鄒小燕,李金華,葛發(fā)歡,等.高效液相色譜法測(cè)定不同產(chǎn)地杜仲葉的綠原酸含量【J】.中外醫(yī)療,2008,27(20):10-11.

StudyonextractiontechnologyofchlorogenicacidfromleavesofEucommiaulmoidesOlivinZunyi

Xiaoyuan,Liwenna,Huangxienan,Chenyang

(Zhuhai Campus of Zunyi Medical College,Guangdong Zhuhai 519041,China)

ObjectiveTo optimize the extraction parameters of chlorogenic acid from leaves ofEucommiaulmoidesOliv.MethodsThe efficiency of extraction parameters was evaluated by detecting the chlorogenic acid extraction rate and the extraction parameters were optimized by single factor and orthogonal experiments.ResultsUsing ultrasonic (25kHz) extraction technology,when the powder of leaves ofEucommiaulmoidesOliv.was treated with 60% ethanol at a herb to solution ratio of 1∶12 and pH 5 for 30 min,the highest extraction rate (2.54%) of chlorogenic acid was obtained.ConclusionThe optimal parameters of ultrasonic technology for chlorogenic acid extraction from the leaves ofEucommiaulmoidesOliv.are that 60% ethanol is used as solvent with the herb to solution ratio of 1∶12 and pH 5 for 30 min.

leaf ofEucommiaulmoidesOliv;chlorogenic acid;extraction technology

貴州省中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目(NO：QZYY-2010-60)；遵義醫(yī)學(xué)院博士啟動(dòng)基金項(xiàng)目(NO：F-127)。

李文娜，女，博士,副教授,研究方向：心血管藥理與新藥研發(fā)，E-mail:lielizabeth@126.com。

R28

A

1000-2715(2012)05-0383-03

【收稿2012-05-24；修回2012-09-11】

(編輯：譚秀榮)