肖菊平，田 虹，曾俊偉，肖 智，劉曉紅

(遵義醫(yī)學(xué)院 生理學(xué)教研室， 貴州 遵義 563099)

皮質(zhì)酮促進(jìn)大鼠脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞糖皮質(zhì)激素受體表達(dá)

肖菊平，田 虹，曾俊偉，肖 智，劉曉紅

(遵義醫(yī)學(xué)院 生理學(xué)教研室， 貴州 遵義 563099)

目的觀察皮質(zhì)酮(CORT)對(duì)培養(yǎng)的大鼠脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞糖皮質(zhì)激素受體(GR)表達(dá)的影響。方法培養(yǎng)純化新生SD大鼠脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞，免疫熒光標(biāo)記、免疫印跡技術(shù)檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞GR表達(dá)的變化。結(jié)果培養(yǎng)的脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞均表達(dá)GR，CORT可升高星形膠質(zhì)細(xì)胞GR表達(dá)。結(jié)論藥理劑量的CORT可促進(jìn)脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞GR表達(dá)。

皮質(zhì)酮；糖皮質(zhì)激素受體；脊髓；星形膠質(zhì)細(xì)胞

糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoid，GC)具有抗炎、抑制免疫反應(yīng)和膜穩(wěn)定等作用。近年的研究顯示，GC在傷害性信息的傳遞及病理性疼痛時(shí)中樞痛敏的形成發(fā)展中也起著重要的作用【1-4】。外周神經(jīng)損傷時(shí)，脊髓背角糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid reccptor，GR)表達(dá)增加，且GR表達(dá)與熱痛敏和機(jī)械痛敏的發(fā)展在時(shí)間上呈現(xiàn)一致性，鞘內(nèi)給予GR拮抗劑可明顯減輕神經(jīng)痛癥狀，表明中樞GR表達(dá)促進(jìn)了病理性神經(jīng)痛的發(fā)生和發(fā)展【2,5】。

脊髓背角是機(jī)體對(duì)傷害性信息進(jìn)行調(diào)制和整合的重要位點(diǎn)。新近研究結(jié)果表明，脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞在病理性疼痛的發(fā)生與維持中起著關(guān)鍵作用。在外周神經(jīng)損傷模型、外周炎性疼痛以及癌痛模型中，均有不同程度的脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞活化， 同時(shí)伴有胞外K+和Glu濃度升高、脊髓背角感覺神經(jīng)元興奮性升高【6,7】。神經(jīng)系統(tǒng)幾乎所有星形膠質(zhì)細(xì)胞均有GR表達(dá)，脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞也存在GR表達(dá)【8】。近年諸多實(shí)驗(yàn)證實(shí)GR參與了星形膠質(zhì)細(xì)胞活性調(diào)節(jié)，通過(guò)抑制或增強(qiáng)星形膠質(zhì)細(xì)胞活性而參與不同的生理和病理過(guò)程【9-11】。然而，影響星形膠質(zhì)細(xì)胞GR表達(dá)的因素并不十分清楚。在傷害性刺激等應(yīng)急狀態(tài)下,機(jī)體GC分泌顯著增加，高濃度的GC是否會(huì)影響脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞GR表達(dá)及活性，尚未見報(bào)道。本研究采用免疫熒光多重顯色及免疫印跡技術(shù)，觀察到培養(yǎng)的脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞均有GR表達(dá)，皮質(zhì)酮(corticosterone，CORT)可導(dǎo)致星形膠質(zhì)GR表達(dá)升高。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和器材 1～3 d SD乳鼠，由重慶第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的成年大鼠 【許可證號(hào)SCXK(渝) 2007-0005】 所生；DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶為Hyclone 產(chǎn)品；兔源GR抗體、小鼠源膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP) 抗體為美國(guó)Santa 公司產(chǎn)品；CORT為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品;激光掃描共聚焦顯微鏡 (德國(guó) Leica TCS SP2)；DU-600紫外分光光度計(jì)(Beckman，美國(guó))；電泳儀、電泳槽、TRANS-BLOT SD半干電轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(BioRad，美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定 SD 乳鼠 (<3 d),乙醚麻醉,75%乙醇消毒,解剖顯微鏡下取出脊髓背角組織,1.25 mg/ mL 胰蛋白酶37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化30 min,胎牛血清終止消化,吹打成細(xì)胞懸液,接種于75 mL培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),放置于含5%CO2、37 ℃ 培養(yǎng)箱內(nèi)。培養(yǎng)10 d 后細(xì)胞鋪滿瓶底，傳代兩次后接種在蓋玻片上培養(yǎng)24 h,40 g/ L多聚甲醛固定15 min,0.01 mol/ L PBS 漂洗,加入小鼠源GFAP 單克隆抗體1∶100,37 ℃ 1 h,4 ℃ 過(guò)夜后取出,加入山羊抗小鼠IgG (1:200)，37 ℃ 1 h。顯微鏡下觀察GFAP 陽(yáng)性細(xì)胞為星形膠質(zhì)細(xì)胞，GFAP 陽(yáng)性細(xì)胞>98%。

1.2.2 脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞GR及GFAP免疫熒光雙重標(biāo)記 將純化的星形膠質(zhì)細(xì)胞接種于小蓋玻片上,接種密度104個(gè)，培養(yǎng)24 h；4%多聚甲醛固定10min,0.01mol PBS 漂洗；加入含兔GR抗體的抗體稀釋液1∶100，37℃孵育2h，4℃過(guò)夜； 0.01mol/L PBS 漂洗5 min×3 次,入含有DyLightTM488 標(biāo)記的山羊抗兔IgG的0.01mol/L PBS(1∶200)中37℃ 1 h；0.01mol/L PBS 漂洗5 min×3 次,入含小鼠GFAP抗體的抗體稀釋液(1∶200)37℃1 h，4℃ 過(guò)夜；0.01mol/L PBS 漂洗5 min×3次,入含有DyLightTM594標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG的0.01mol/L PBS(1∶200)中37℃1h； 0.01mol/L PBS 漂洗5 min×3次， DAPI(1∶1000)孵育5min標(biāo)記所有細(xì)胞核DNA，0.01mol/L PBS 漂洗5 min×3次；甘油:PBS = 1∶1 的封片液封片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖象。陰性對(duì)照以0.01mol/L PBS代替一抗，其余步驟完全相同，注意避光操作。星形膠質(zhì)細(xì)胞核GR表達(dá)強(qiáng)度用 Image - Pro Plus 6.0 專業(yè)圖像分析軟件分析，采集選定細(xì)胞核的平均光密度值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.3 免疫印跡技術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞GR蛋白 取生長(zhǎng)良好、已融合成片的純化脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞，提取各組細(xì)胞總蛋白，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度，每孔蛋白上樣量30 μg 行 SDS- PAGE 電泳，半干轉(zhuǎn)儀將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜上，6 %脫脂奶粉封閉2 h，加入兔抗GR多抗(1∶250)，同時(shí)加入小鼠抗β-actin單抗(1∶2000)，4℃孵育過(guò)夜。PBS 洗膜，加入抗兔HRP-IgG和抗鼠HRP-IgG(1∶2500)，室溫反應(yīng)1h。加化學(xué)發(fā)光顯色試劑，X 射線曝光顯影，β- actin 為內(nèi)參照，掃描分析軟件系統(tǒng)(LabworksTMAnalysis Software，美國(guó)) 分析數(shù)據(jù)，分析結(jié)果以每個(gè)條帶的積分光密度(IOD) 值與其相對(duì)應(yīng)的β-actin的IOD值之比表示蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用 SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，兩組間差異比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn),多組均數(shù)間差異比較用單因素方差分析，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)和純度鑒定 倒置相差顯微鏡下見原代培養(yǎng)的脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)在底層,上層有少突膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)(見圖1A)。經(jīng)傳代純化的脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞以原漿型為主，呈片狀生長(zhǎng)，細(xì)胞邊界清楚,胞體扁平,形態(tài)不規(guī)則，核漿界限清楚，胞核呈圓或卵圓形，常位于胞體一側(cè)(見圖1B)。GFAP為星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物,用免疫組化方法鑒定培養(yǎng)的細(xì)胞中GFAP免疫反應(yīng)陽(yáng)性率>98%，表明培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞純度高(見圖1C)。

2.2 脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)GR 免疫熒光雙重染色結(jié)合DAPI核標(biāo)記顯示，幾乎所有培養(yǎng)的脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞均表達(dá)GFAP (紅色)和GR (綠色)，而在陰性對(duì)照細(xì)胞只有4',6-diamidino -2-phenylindole(DAPI)核DNA標(biāo)記藍(lán)色熒光。激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察， GR主要表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞胞漿和胞核(見圖2)。

2.3 皮質(zhì)酮對(duì)培養(yǎng)脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞GR表達(dá)的影響 免疫熒光染色結(jié)果顯示,不同濃度CORT (0.1μmol/L,1μmol/L,10μmol/L)孵育3 h,脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞GR表達(dá)增加,尤其是細(xì)胞核GR表達(dá)增強(qiáng)最為顯著(見圖3) 。對(duì)不同濃度CORT作用的星形膠質(zhì)細(xì)胞核進(jìn)行光密度統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示，CORT在0.1～10μmol/L，隨著濃度的增加，星形膠質(zhì)細(xì)胞GR表達(dá)逐漸增強(qiáng)(P<0.01，見圖4)。 同樣，免疫印跡技術(shù)亦檢測(cè)到，在1μmol/L CORT作用下，培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞GR蛋白量明顯增加(P<0.01，見圖5)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，藥理濃度的CORT可促進(jìn)培養(yǎng)的脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞GR表達(dá)。

注： A：原代培養(yǎng)的星型膠質(zhì)細(xì)胞； B：傳代純化的星型膠質(zhì)細(xì)胞； C：純化的脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP表達(dá)。圖1 培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)及純度鑒定

注： A:DAPI標(biāo)記核DNA;B:GFAP表達(dá);C:GR表達(dá);D:同一視野下A,B,C合并。圖2 免疫熒光雙重染色觀察脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞GR表達(dá)

注：A:control;B:0.1μmol/L CORT;C:1μmol/L CORT;D:10μmol/L CORT。圖3 CORT導(dǎo)致脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞GR表達(dá)增高

注：**P<0.01，與對(duì)照組比較。圖4 CORT(0.1-10μmol/L)隨著濃度的增加，脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞GR表達(dá)逐漸增強(qiáng)

注：A:GR蛋白免疫印跡檢測(cè)結(jié)果； B:免疫印跡檢測(cè)GR蛋白表達(dá)的統(tǒng)計(jì)分析；**P<0.01，與對(duì)照組比較。圖5 CORT(1μmol/L)致脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞GR蛋白表達(dá)增加

3 討論

Yan等通過(guò)免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察到，在成年大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞存在GR表達(dá)【8】。本實(shí)驗(yàn)免疫熒光雙重標(biāo)記檢測(cè)表明，幾乎所有體外培養(yǎng)的大鼠脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞均表達(dá)GR，這為進(jìn)一步探索GC通過(guò)GR調(diào)節(jié)脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞活性的功能研究提供了形態(tài)學(xué)依據(jù)。

GC對(duì)機(jī)體內(nèi)多種組織和細(xì)胞發(fā)揮著廣泛的作用，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育與分化、神經(jīng)元的損傷與再生以及突觸可塑性等均有重要的調(diào)節(jié)作用。近年的研究顯示， GR參與了痛覺信息的傳導(dǎo)，外周神經(jīng)損傷時(shí)，脊髓背角GR表達(dá)增加促進(jìn)了病理性神經(jīng)痛的發(fā)生和發(fā)展【2,5】。然而神經(jīng)病理性疼痛時(shí)，究竟哪些因素促進(jìn)了中樞GR表達(dá)變化，并不十分清楚。傷害性刺激導(dǎo)致疼痛時(shí)，機(jī)體分泌GC顯著增加，高濃度的GC是否會(huì)影響脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞GR表達(dá)尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)采用免疫熒光及免疫印跡技術(shù)均觀察到，在藥理劑量的CORT作用下，培養(yǎng)的脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞GR表達(dá)明顯增加，呈現(xiàn)劑量依賴性。GR表達(dá)增加能否調(diào)節(jié)脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性，繼而促進(jìn)或者抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放某些神經(jīng)遞質(zhì)如Glu，轉(zhuǎn)而參與脊髓水平痛覺信息的調(diào)制有待進(jìn)一步研究。

RU38486是糖皮質(zhì)激素胞漿受體拮抗劑，可阻止糖皮質(zhì)激素與其胞漿受體的結(jié)合。我們前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鞘內(nèi)給予GR拮抗劑RU38486可明顯減輕坐骨神經(jīng)慢性壓迫損傷所致的神經(jīng)痛【12】，RU38486的鎮(zhèn)痛作用是否部分通過(guò)脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞而發(fā)揮作用尚待進(jìn)一步研究確定。

【1】 Alexander J K,DeVries A C,Kigerl K A,et al.Stress exacerbates neuropathic pain via glucocorticoid and NMDA receptor activation【J】.Brain Behav Immun,2009,23(6):851-860.

【2】 Wang S,Lim G,Zeng Q,et al.Central glucocorticoid receptors modulate the expression and function of spinal NMDA receptors after peripheral nerve injury【J】.J Neurosci,2005,25(2):488-495.

【3】 Wang S,Lim G,Yang L,et al.Downregulation of spinal glutamate transporter EAAC1 following nerve injury is regulated by central glucocorticoid receptors in rats【J】.Pain,2006,120 (1-2):78-85.

【4】 Wang S,Lim G,Mao J,et al.Central glucocorticoid receptors regulate the upregulation of spinal cannabinoid-1 receptors after peripheral nerve injury in rats【J】.Pain,2007,131(1-2):96-105.

【5】 Takasaki I,Kurihara T,Saegusa H,et al.Effects of glucocorticoid receptor antagonists on allodynia and hyperalgesia in mouse model of neuropathic pain【J】.Eur J Pharmacol,2005,524(1-3):80-83.

【6】 Hald A,Nedergaard S,Hansen R R，et al.Differential activation of spinal cord glial cells in murine models of neuropathic and cancer pain【J】.Eur J Pain,2009,13(2):138-145.

【7】 Wang W,Wang Y,Huang J,et al.Temporal changes of astrocyte activation and glutamate transporter-1 expression in the spinal cord after spinal nerve ligation-induced neuropathic pain【J】.Anat Rec (Hoboken),2008,291(5):513-518.

【8】 Yan P,Xu J,Li Q,et al.Glucocorticoid Receptor Expression in the Spinal Cord after Traumatic Injury in Adult Rats【J】.The Journal of Neuroscience,1999,19(21):9355-9363.

【9】 Crossin K L,Tai M H,Krushel L A,et al.Glucocorticoid receptor pathways are involved in the inhibition of astrocyte proliferation【J】.Proc Natl Acad Sci U S A,1997,94(6):2687-2692.

【10】 Liu Y,Imai H,Sadamatsu M,et al.Cytokines participate in neuronal death induced by trimethyltin in the rat hippocampus via type II glucocorticoid receptors【J】.Neurosci Res,2005,51(3):319-327.

【11】 Revsin Y,Rekers N V,Louwe M C,et al.Glucocorticoid receptor blockade normalizes hippocampal alterations and cognitive impairment in streptozotocin-induced type 1 diabetes mice【J】.Neuropsychopharmacology,2009,34(3):747-758.

【12】 李敏，肖菊平，曾俊偉，等.脊髓糖皮質(zhì)激素受體在神經(jīng)病理性疼痛中的作用【J】.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2012,34 (17):1719-1721.

Elevationofglucocorticoidreceptorexpressioninratdorsalspinalcordastrocytesbycorticosterone

Xiaojuping,Tianhong,Zengjunwei,Xiaozhi,Liuxiaohong

(Department of Physiology,Zunyi Medical College,Guizhou Zunyi 563099,China)

ObjectiveTo investigate the effects of corticosterone -(CORT) on glucocorticoid receptor(GR) expression in cultured rat dorsal spinal cord astrocytes.MethodsAstrocytes from neonatal SD rat spinal cord were cultured and purified.Astrocyte GR expression was detected by immunofluorescence and western blot assay.ResultsImmunofluorescence labeling indicated that GR were shown in most of glial fibrillary acidic protein -(GFAP) positive cultured dorsal spinal cord astrocytes.CORT increased astrocyte GR protein expression.ConclusionCORT could promote GR expression in cultured dorsal spinal cord astrocytes.

corticosterone;glucocorticoid receptor;spinal cord;astrocyte

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(NO：30960126)；遵義醫(yī)學(xué)院博士科研啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目(NO： 2008)。

劉曉紅,女，博士，教授，研究方向：疼痛生物學(xué)機(jī)制研究，E-mail:lxh680718@yahoo.com.cn。

R329.27;R338.1

A

1000-2715(2012)05-0367-04

【收稿2012-08-12；修回2012-09-02】

(編輯：譚秀榮)