葉建州， 楊雪松，李 欽

（1.云南省中醫(yī)醫(yī)院，云南 昆明650021；2.云南省中醫(yī)中藥研究院，云南 昆明650223）

角質(zhì)層是皮膚表皮的最外層，能直接體現(xiàn)出皮膚的外觀和健康狀況，并在保障皮膚正常的屏障功能上起重要作用。神經(jīng)酰胺（ceramide）是一種類磷脂，它占角質(zhì)層脂質(zhì)中40%～50%比重，是角質(zhì)層的主要成分，它在保持角質(zhì)層水分平衡，維護皮膚屏障功能起到極其重要的作用，相當于角質(zhì)細胞磚之間泥漿的主要成分，表皮層除去神經(jīng)酰胺就能使皮膚屏障功能幾近喪失。

特應(yīng)性皮炎（atopic der matitis，AD）患者不僅病變部位皮膚神經(jīng)酰胺的含量明顯減少，并且正常皮膚處神經(jīng)酰胺的含量也較正常人低，經(jīng)表皮喪失水分也叫正常人多，常伴有皮膚干燥癥［1～2］。皮膚神經(jīng)酰胺含量的減少是特應(yīng)性皮炎患者皮膚屏障功能低下的指標。瘙癢是特應(yīng)性皮炎的一個重要特征［3］。

本實驗通過復(fù)制大黃所致脾虛動物模型并進一步復(fù)制瘙癢（血燥）模型，通過程度其表皮神經(jīng)酰胺含量這一皮膚屏障功能的重要指標，瘙癢行為及表皮厚度，探討健脾養(yǎng)血祛風法對皮膚機械屏障功能的影響，探索特應(yīng)性皮炎中醫(yī)治療規(guī)律及機制。

1 實驗基礎(chǔ)條件測定、儀器及材料

1.1 小鼠表皮脂質(zhì)的抽提及表皮中神經(jīng)酰胺含量測定

1.1.1 取材 選用ICR小鼠，將小鼠處死，剪毛，取下剪毛后的皮膚，用直徑為8 mm的打耳器經(jīng)剪下的皮膚打成0.5 c m2大小的皮膚圓片，每只鼠打6個圓片作為一份皮膚樣品，總面積為3 c m2

1.1.2 實驗儀器 BIO－RAD Gel Doc凝膠成像系統(tǒng)，勻漿機FLUKO F6／10，高速離心機 北京京立離心機有限公司LG10－2.4 A，低溫冰箱 日本產(chǎn)SANYO MDF－U33，電子天平上海普利塞斯有限公司XS125A。

1.1.3 藥品與試劑 神經(jīng)酰胺標準品和朊酶：美國西格瑪公司，氮氣（昆明氧氣廠），磷酸鹽緩沖液（PBS液），正乙烷，乙酸乙酯，氯仿，甲醇氨水，硫酸銅，磷酸，醋酸 產(chǎn)自國藥集團化學(xué)試劑有限公司（均為分析純）；其他材料：定量毛細管，薄層色譜硅膠板，定量濾紙，薄層色鋪展開缸，耳腫打耳器，移液器。

1.1.4 表皮中神經(jīng)酰胺含量測定 將所取皮膚浸泡于朊酶液中，放置過夜，分離表皮，按Blight＆Dyer法［4］抽提表皮脂質(zhì)，－40℃保存。

1.1.4.1 對照品溶液的制備 精密稱取神經(jīng)酰胺對照品0.0052 g，置5 mL容量瓶中，加氯仿適量，振搖使溶解，加氯仿稀釋至刻度，搖勻。從中精密吸取1 mL溶液，置5 mL容量瓶中加氯仿適量，振搖使溶解，加氯仿稀釋至刻度，搖勻。即得0.208 mg／mL對照品溶液。用0.10 mL氯仿溶解所抽提出的脂質(zhì)，即得供試品溶液。

1.1.4.2 供試品溶液的制備 用0.10 mL氯仿溶解所抽提的脂質(zhì)，即得供試品溶液。

1.1.4.3 薄層色譜條件 薄層板：北京頗賽科技公司Silca gel 60，點樣：點樣基線距底邊1 c m，將樣品點于基線上。展開：薄層板于氯仿：甲醇：水（80∶20∶1）中上行展開，取出晾干。顯色：硫酸銅磷酸溶液顯色，與140℃下烘至顯色。

1.1.4.4 含量測定方法 顯色后的薄層板用BIO－RAD Gel Doc凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，Quantity One軟件分析，進行含量測定。

1.1.4.5 方法學(xué)考察 工作曲線的繪制：精密吸取對照品溶液2、4、6、8、101分別點于統(tǒng)一薄層板上，按上述薄層色譜條件展開、顯色、采集圖像、分析定量。經(jīng)神經(jīng)酰胺線性關(guān)系考察后，利用回歸方程計算相關(guān)系數(shù)，表明神經(jīng)酰胺在0.416～2.08μg范圍內(nèi)，含量與密度積分值線性關(guān)系良好。

1.2 瘙癢測定方法［5］

1.2.1 造模方法 于造模前1 d，剪掉頸背部毛，用4 c m2脫脂棉蘸取丙酮、乙醚混合液（1：1）覆蓋于剪毛處15 s，而后取另一4 c m2脫脂棉蘸取蒸餾水覆蓋于剪毛處30 s，2次／d，2次時間間隔至少為6 h。

1.2.2 瘙癢行為［5］于第14 d觀察各組動物瘙癢行為，在BI－2000醫(yī)學(xué)圖像分析儀系統(tǒng)下錄像2小時10秒，前10 min為適應(yīng)期，錄像結(jié)束后觀察并記錄后2 h內(nèi)各組動物的以后足搔抓造模部位的次數(shù)。

2 方法與結(jié)果

2.1 實驗方法及藥物制備 將70只體重在18～25 g的ICR小鼠隨機分為7組，清潔級，雌雄各半，每組10只（由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所提供，許可證號：SCXK（川））。分為空白組，大黃模型組，治療高劑量組，治療低劑量組，預(yù)防模型組，預(yù)防高劑量組，預(yù)防低劑量組。大黃濃縮液：以大黃水煎、過濾、合并濾液、濃縮制成浸膏，以蒸餾水稀釋為200%藥液，4℃保存。健脾養(yǎng)血祛風方：按方中比例水煎、過濾、合并濾液、濃縮制成浸膏，以蒸餾水稀釋為120%藥液，4℃保存。

2.2 造模方法 對照組給予等量蒸餾水。模型組：大黃組［6］，灌胃給予200%大黃水煎液，0.5 mL／只，1次／d，連續(xù)8 d，造成瀉下脾虛模型。治療高劑量組：灌胃給予200%大黃水煎液，0.5 mL／只，1次／d，連續(xù)8 d，造成瀉下脾虛模型，第9 d同時開始給予瘙癢2次／d，2次間隔大于6 h，連續(xù)5 d，共13 d。第11 d時灌胃24.375 g生藥／kg健脾養(yǎng)血祛風方濃縮液，1次／d。治療低劑量組：灌胃給予200%大黃水煎液，0.5 mL／只，1次／d，連續(xù)8 d，造成瀉下脾虛模型，第9 d同時開始給予瘙癢2次／d，兩次間隔大于6 h，連續(xù)5 d，共13 d。第11 d時灌胃8.125 g生藥／kg健脾養(yǎng)血祛風方濃縮液，1次／d。預(yù)防模型組：灌胃蒸餾水5 d后，第6 d灌胃給予200%大黃水煎液，0.5 mL／只，1次／d，連續(xù)8 d，造成瀉下脾虛模型，第9 d同時開始給予瘙癢2次／日，2次間隔大于6 h，連續(xù)5 d，共13 d。預(yù)防高劑量組：灌胃24.375 g生藥／kg健脾養(yǎng)血祛風方（組成：黃芪30 g，白術(shù)15 g，當歸15 g，制首烏30 g，防風20 g，刺蒺藜30 g，蜈蚣15 g）濃縮液，1次／日，5 d后，第6 d灌胃給予200%大黃水煎液，0.5 mL／只，1次／日，連續(xù)8 d，第9 d同時開始予瘙癢2次／d，2次間隔大于6 h，連續(xù)5 d，共13 d。

預(yù)防低劑量組：灌胃8.125 g生藥／kg健脾養(yǎng)血祛風方濃縮液，1次／日，5 d后，第6 d灌胃給予200%大黃水煎液，0.5 mL／只，1次／日，連續(xù)8 d，第9 d同時開始予瘙癢2次／日，2次間隔大于6 h，連續(xù)5 d，共13 d。

2.3 觀察指標

2.3.1 一般行為［7］觀察各組動物的行為狀態(tài)，注意觀察大黃組動物是否出現(xiàn)精神倦怠，嗜臥，懶動，拱背，扎堆，眼瞇，毛色枯黃，甚至稀少，耳，尾色白，軟便，便溏，泄瀉，體重增長減慢或體重下降，食量減少等脾虛癥狀。出現(xiàn)5個以上即可認為脾虛模型復(fù)制成功。

2.3.2 表皮神經(jīng)酰胺測定 按“小鼠表皮脂質(zhì)的抽提及表皮中神經(jīng)酰胺含量測定方法研究”中方法取皮，抽提出表皮脂質(zhì)并測定其中神經(jīng)酰胺的含量。

2.3.3 瘙癢行為 按上文“瘙癢方法”統(tǒng)計各組小鼠瘙癢次數(shù)并比較各組間差異。

2.4 統(tǒng)計方法 神經(jīng)酰胺，瘙癢次數(shù)和表皮厚度統(tǒng)計方法：用多個樣本均數(shù)間兩兩比較，q檢驗的方法，（Newmankueuls法）。

2.5 實驗結(jié)果 大黃組動物灌胃給予大黃，大黃治療模型組：2天后出現(xiàn)便軟，稀便，第4天出現(xiàn)腹瀉，稀水便，懶動，扎堆，毛憔悴。體重增長減慢，進食量減少?？瞻捉M動物無異常情況，體重增加迅速，進食量增加。

表2 瘙癢次數(shù)測定結(jié)果

表3 各組動物剪毛造模部位表皮厚度測量結(jié)果

3 討論

特應(yīng)性皮炎是中醫(yī)學(xué)“浸淫瘡”，“奶癬”及“四彎風”范疇。多因“先天稟性不耐，脾失健運，水濕停滯，化熱內(nèi)生，浸淫肌膚“而發(fā)病。脾失統(tǒng)導(dǎo)致在疾病早期津液大量外滲，滲液日久不僅使脈中之津液不足，脈絡(luò)空虛，因虛而致風，血虛風燥，膚失所養(yǎng)而遷延不愈。其病理基礎(chǔ)是以虛為本，以風濕熱邪為標。主要表現(xiàn)為脾虛濕熱證（急性濕疹），脾虛濕阻證（亞急性濕疹），脾虛血燥證（慢性濕疹）3型。急性期為脾失健運，運化失司，濕濁內(nèi)蘊，日久化熱，浸于肌膚，久則生風化燥，脾虛血燥肌膚失養(yǎng)［8］。急性期以清熱解毒、健脾滲濕為主，慢性期以健脾養(yǎng)血，祛風止癢為主，并在此基礎(chǔ)上根據(jù)兼有癥狀加減已成為共識，治療中不能一味地清熱利濕［9］，基于特應(yīng)性皮炎的癥狀特點，結(jié)合中醫(yī)病因病機學(xué)說，臨床用藥規(guī)律和現(xiàn)代中醫(yī)研究成果，脾虛是特應(yīng)性皮炎患者的體質(zhì)特征，慢性期脾虛血燥患者可能有不同程度的皮膚屏障功能障礙。瘙癢可促使淋巴細胞釋放化學(xué)因子如白介素1а等，不但是瘙癢進一步加劇，而且導(dǎo)致濕疹樣皮疹的產(chǎn)生和加重，并形成惡性瘙癢－搔抓循環(huán)。在長期的臨床時間中觀察到特應(yīng)性皮炎患者大多表現(xiàn)為皮損肥厚、干燥、脫細屑、納差、便溏等脾虛血燥證的表現(xiàn)。無論從中醫(yī)基礎(chǔ)理論分析還是多年的臨床實踐來看特應(yīng)性皮炎的辨證治療均緊密圍繞以脾為主的辨治思路，慢性期則為久病耗傷脾氣，氣血生化之源受損，脾虛亦為血虛之本，而”血虛不能養(yǎng)膚，風從內(nèi)生”，脾虛血燥貫穿特應(yīng)性皮炎整個慢性期過程。近年來，特應(yīng)性皮炎患病率居高不下，三歲以內(nèi)的兒童患病率為44%［10］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，特應(yīng)性皮炎病因?qū)W主要涉及皮膚的機械屏障和免疫屏障功能的異常［11］。

基于特應(yīng)性皮炎的癥狀特點，結(jié)合中醫(yī)病因病機學(xué)說，臨床用藥規(guī)律和現(xiàn)代中醫(yī)研究成果，脾虛是特應(yīng)性皮炎患者的體質(zhì)特征，脾虛血燥患者可能有不同程度的皮膚屏障功能障礙。本文對脾虛血燥與皮膚機械屏障功能關(guān)系進行了實驗研究。結(jié)果顯示，皮膚機械屏障功能瘙癢模型組小鼠神經(jīng)酰胺含量下降，瘙癢次數(shù)增多，表皮厚度增厚，與空白組比較，有明顯統(tǒng)計學(xué)意義。治療高、低劑量組及預(yù)防高、低劑量組的神經(jīng)酰胺含量升高，瘙癢次數(shù)減少，表皮厚度變薄比較皮膚機械屏障功能瘙癢模型組小鼠有顯著性差異。健脾養(yǎng)血祛風湯組成方藥為云南省中醫(yī)醫(yī)院皮膚科已故劉復(fù)興主任醫(yī)師的經(jīng)驗方。其方健脾養(yǎng)血祛風止癢，健脾益血，水谷精微化生有源，津血同源，氣血健運，津液濡潤，肌膚腠理得養(yǎng)，皮膚屏障功能得以維持。

苦寒藥致脾虛是目前最常用的脾虛造模方法。《脾胃論》：“大忌苦寒之藥傷其脾胃?！迸R床過用苦寒及苦寒瀉下常致耗氣破氣，脾胃氣虛。大黃為苦寒瀉下法中最常用的藥物，其性寒味苦，含多量蒽醌衍生物?？嗪疄a下法致致脾虛屬脾氣虛。

瘙癢是以特應(yīng)性皮炎為代表的一類干燥性皮膚病的臨床主要癥狀之一，也是皮膚屏障功能障礙的主要癥狀表現(xiàn)［12～13］，反復(fù)搔抓皮膚可使皮膚病變惡化和遷延，使瘙癢進一步加劇，本研究選用丙酮、乙醚混合液致小鼠皮膚瘙癢，原理基于皮膚與有機溶劑接觸可提取皮膚脂質(zhì)，致皮膚屏障功能顯著降低［14］。通過復(fù)制大黃所致脾虛動物模型并進一步復(fù)制瘙癢（血燥）模型，通過程度其表皮神經(jīng)酰胺含量這一皮膚屏障功能的重要指標，及表皮厚度、瘙癢行為，探討脾虛血燥與皮膚機械屏障功能的關(guān)系。

中醫(yī)藥治療特應(yīng)性皮炎有其獨特的優(yōu)勢，過去我們在對過敏性皮膚病的臨床及實驗研究中過分強調(diào)中藥的抗炎、抗組胺作用，但抗炎、抗過敏難以體現(xiàn)中醫(yī)藥治療過敏性皮膚疾病的優(yōu)勢。許多中藥中藥制劑在實驗研究中確實表現(xiàn)出一定程度的抗炎、抗組胺的作用，可強度遠不及抗組胺藥、糖皮質(zhì)激素類藥物；在臨床治療上中藥雖然起效慢，但遠期療效好，復(fù)發(fā)率低是客觀事實，許多患者是在抗組胺藥、糖皮質(zhì)激素治療無效的情況下，轉(zhuǎn)用中藥治療而獲效的，提示我們中藥可能是通過其他途徑發(fā)揮治療作用的。

4 結(jié)論

健脾養(yǎng)血祛風法可以減輕大黃法所致脾虛血燥小鼠瘙癢程度，提高神經(jīng)酰胺含量健脾養(yǎng)血祛風法能改善大黃法所致小鼠脾虛血燥證的皮膚機械屏障功能障礙。脾虛血燥證在研究脾虛與皮膚這一人體最大器官關(guān)系的動物模型尚不多，本實驗為今后建立復(fù)合型及最大程度接近臨床疾病癥狀，解釋證的本質(zhì)的研究，用動物模型提供了思路與依據(jù)。

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