王鳳鳴沈雙李瓊 劉彤 孫靜

1.江蘇省常州市疾病預防控制中心，江蘇常州 213022；2.蘇州大學醫(yī)學生物技術研究所，江蘇蘇州 215007；3.江蘇省血吸蟲病防治研究所，江蘇無錫 214000

Graves′病患者外周血T細胞表面膜型CD 28及血清中可溶性CD 28的表達及其意義

王鳳鳴1,2沈雙2,3李瓊1劉彤2孫靜2

1.江蘇省常州市疾病預防控制中心，江蘇常州 213022；2.蘇州大學醫(yī)學生物技術研究所，江蘇蘇州 215007；3.江蘇省血吸蟲病防治研究所，江蘇無錫 214000

目的分析Graves′?。℅raves′disease，GD）患者外周血T細胞表面膜型CD28及血清中可溶性CD28的表達水平，探討CD28分子在GD免疫病理機制中的作用。方法選取105例GD患者為試驗組，67例健康者為對照組，通過溶血及流式細胞術檢測所有受試對象外周血T細胞表面膜型CD28的表達，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測血清中可溶性CD28的含量。結果試驗組外周血CD4+CD28+T細胞為（23.367±8.562）%，CD8+CD28+T細胞為（10.156±3.114）%，較對照組[分別為（30.786±5.143）%和（17.200±3.624）%]顯著減少（P＜0.0.5、P＜0.0.1），血清中可溶性CD28水平觀察組[（2.35±0.58）μg/L]較對照組[（0.53±0.23）μg/L]顯著增加（P＜0.01）。結論共刺激分子CD28很有可能參與了GD的免疫病理機制。

膜型CD28；可溶性CD28；Graves′病

Graves′?。℅D）是一種自身免疫性甲狀腺疾?。╝uto-immune thyroid disease，AITD），目前認為其發(fā)病機制主要是由于細胞表面的促甲狀腺激素受體（thyroid stimulating hormone receptor，TSHR）作為自身抗原誘導產(chǎn)生的促甲狀腺激素受體抗體（thyrotropin receptor antibody，TRAb）與TSHR結合，甲狀腺細胞活化而引起的甲狀腺功能亢進[1]。CD28作為CD28/B7超家族的共刺激分子，在GD免疫病理機制中的生物學作用受到很多學者的關注。CD28分子表達在人類95%的CD4+T細胞及50%CD8+T細胞表面，參與T細胞的活化、增殖、分化及發(fā)揮免疫效應功能。本文就GD患者外周血T細胞表面膜型CD28的表達及血清中可溶性CD28的水平進行了分析，進而探討該分子在GD免疫病理機制中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2009年1月～2010年12月在蘇州市立醫(yī)院本部和蘇州大學附屬第一人民醫(yī)院門診和住院的GD患者105例作為試驗組，其中男18例，女87例；年齡（38.04±13.16）歲。同時從蘇州市立醫(yī)院本部和蘇州大學附屬第一人民醫(yī)院健康體檢者中選取同一時期的67例年齡和性別與實驗組相匹配的健康受試者作為對照組，其中男10例，女57例；年齡（37.36±9.54）歲。GD的診斷標準為：高代謝癥候群，甲亢診斷成立；觸診和B超檢查證實有甲狀腺腫大，呈彌漫性；伴或不伴浸潤性突眼；TRAb和甲狀腺刺激抗體（thyroid stimulating antibody，TSAb）陽性；核素掃描顯示甲狀腺吸碘率彌漫性增強。所有GD患者均無其他自身免疫性疾病、腫瘤和感染性疾病等，半年內均未使用過影響免疫功能的藥物；均常規(guī)測定甲狀腺功能和TRAb。

1.2 試劑與儀器

異硫氰酸熒光素（FITC）標記的小鼠抗人單克隆抗體CD4（CD4-FITC）、CD8-FITC、藻紅蛋白（PE）標記的CD28（CD28-PE）以及同型對照抗體IgG1-FITC、IgG1-PE（Immunotech公司，法國），溶血劑（Invitrogen公司，美國）?？扇苄訡D28的ELISA檢測試劑盒由蘇州大學醫(yī)學生物技術研究所構建。流式細胞儀和離心機（Beckman Coulter公司，美國）、酶標儀（Bio-rad公司，美國）。

1.3 方法

1.3.1 GD患者外周血T細胞表面膜型CD28表達水平的分析取受試對象清晨空腹外周抗凝血2mL，以100μL/管加入流式管中，分別加入10μL/管的CD4-FITC+CD28-PE或者CD8-FITC+CD28-PE，設IgG1-FITC和IgG1-PE為同型對照，室溫避光孵育20 min后加入100μL/管溶血劑，充分混勻后37℃避光孵育10min；加入預溫的蒸餾水，待管中液體澄清透明后，加入3mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌一遍后，以0.5mL PBS重懸細胞，上機檢測。

1.3.2 GD患者血清中可溶性CD28的含量測定取實驗對象清晨空腹靜脈血，經(jīng)高速離心（4 000r/min×5min）分離血清后-20℃冷藏待檢。檢測前，將血清取出室溫解凍后，將血清進行適量的稀釋后按照蘇州大學醫(yī)學生物技術研究所建立的方法檢測可溶性CD28的分泌[2]。

1.4 統(tǒng)計學方法

統(tǒng)計軟件采用SPSS 16.0分析軟件。計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，數(shù)據(jù)分布采用Kolmogorov-Smirnov檢驗，組間比較采用非配對t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 GD患者外周血中膜型CD28分子的表達

采用免疫熒光標記和流式細胞術，檢測試驗組和對照組受試對象外周血不同淋巴細胞亞群及膜型CD28分子的表達。結果發(fā)現(xiàn)，試驗組患者外周血CD4+T細胞較對照組顯著減少（P＜0.05），CD4/CD8顯著降低（P＜0.05），CD4+CD28+T細胞和CD8+CD28+T細胞均顯著減少（P＜0.05、P＜0.01），膜型CD28分子的表達顯著下降（P＜0.01）。見表1。

2.2 GD患者血清中可溶性CD28的含量

經(jīng)自行建立的ELISA方法檢測，試驗組血清中可溶性CD28含量為（2.35±0.58）μg/L，較對照組[（0.53±0.23）μg/L]顯著上調（P＜0.01）。見表2。

3 討論

眾所周知，T細胞的活化除了需要T細胞受體（TCR）-CD3和抗原肽-主要組織相容性抗原（MHC）復合物結合后提供的第一信號外，還需要多個共刺激分子對相互作用產(chǎn)生的第二信號。其中最重要的就是CD28-B7分子，其介導的共刺激信號是特異性細胞免疫應答所必需的。Graves′病是一種自身免疫性的甲狀腺疾病，據(jù)報道，眾多共刺激分子（如CD28-B7[3-4]、CD40-CD40L[5-6]、4-1BB-4-1BBL和OX40-OX40L[7]等）異常表達于GD患者外周血及甲狀腺組織中，且與患者的病情嚴重程度、復發(fā)和預后相關。CD28分子既可以膜型形式表達于T細胞表面，又可以可溶性的形式存在于血液中。一般認為，可溶性CD28主要來源于膜型CD28胞膜外部分的脫落和信使RNA（mRNA）水平剪接和翻譯后的直接分泌[8]。

表1 兩組患者外周血T淋巴細胞亞群的改變及膜型CD28分子的表達（±s，%）

表1 兩組患者外周血T淋巴細胞亞群的改變及膜型CD28分子的表達（±s，%）

組別例數(shù)CD4 CD8 CD4/CD8 CD28 CD4+CD28+CD8+CD28+對照組試驗組P值67 105 45.600±5.720 36.200±7.942＜0.05 25.850±5.830 28.813±6.578＞0.05 1.835±0.373 1.339±0.282＜0.05 52.389±4.068 38.648±7.432＜0.01 30.786±5.143 23.367±8.562＜0.05 17.200±3.624 10.156±3.114＜0.01

表2 兩組患者血清中可溶性CD28的含量比較

本研究發(fā)現(xiàn)，GD患者外周血中存在免疫細胞亞群的失調，無論是CD4+T細胞還是CD8+T細胞表面的膜型CD28分子的表達都顯著下調。近年來的研究表明，在某些病理狀態(tài)下，CD4+T細胞表面的CD28分子表達下調，即CD4+CD28-T細胞增加。體外研究表明，CD4+CD28-T細胞盡管表面丟失了CD28分子，但其在缺失共刺激信號的情況下仍然能夠被功能性活化，產(chǎn)生大量的細胞因子，造成組織損傷。因此，該群細胞也被認為是“自身反應性T細胞”，具有特殊生物學功能，特別是在自身免疫性疾病的免疫病理機制中發(fā)揮著重要的作用。很多研究顯示，自身反應性T細胞異常表達于很多自身免疫病患者外周血中，如類風濕性關節(jié)炎[9]、多發(fā)性硬化癥[10]、強直性脊柱炎[11]和Wegener肉芽腫病等[12]。更有學者認為，自身反應性T細胞的異?；罨芸赡苁荊D發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。GD患者外周血中自身反應性T細胞異常表達于Ⅲ度甲狀腺腫大和合并Graves′病眼病的患者外周血中，并且其表達水平與患者的甲狀腺腫大程度、浸潤性突眼的發(fā)生和甲狀腺自身抗體TRAb的分泌呈正相關。本研究結果提示GD患者外周血中T細胞表面膜型CD28顯著減少，為GD患者外周血中自身反應性T細胞的異常增加提供了佐證。

為了分析GD患者外周血中可溶性CD28的含量，本研究用自制的可溶性CD28 ELISA檢測試劑盒及檢測方法對GD患者和健康者血清中的可溶性CD28的含量進行了檢測。結果顯示，GD患者外周血中可溶性CD28的含量較健康者顯著增加，提示很有可能膜型CD28分子脫落后進入血液，導致可溶性CD28的增加。

總之，CD28作為一個重要的共刺激分子，在機體病理生理狀態(tài)中都發(fā)揮著重要的作用。本研究結果顯示，GD患者外周血中膜型CD28和可溶性CD28均存在異常表達，其在GD免疫病理機制中的具體生物學作用尚待進一步研究。

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The expression and their significance ofmembrane type CD28 on T cells and the production of soluble CD28 in serum from GD patients

WANG Fengming1,2 SHEN Shuang2,3 LIQiong1 LIU Tong2 SUN Jing2
1.Changzhou Center for Disease Control and Prevention,Jiangsu Province,Changzhou 213022,China;2.Institute of Medical Biotechnology,Medical College of Soochow University,Jiangsu Province,Suzhou 215007,China;3.Jiangsu Institute of Parasitic Diseases,Jiangsu Province,Wuxi 214000,China

ObjectiveTo analyze the expression ofmembrane type CD28 on T cells and the serum production of soluble CD28 in peripheral blood from GD patients,to investigate the role of CD28 molecule in the immunological pathogenesis of GD.MethodsThe peripheral blood mononuclear cells(PBMCs)were collected from 105 cases of GD patients as experiment group and from 67 healthy donors as control group.The expression ofmembrane type CD28 in peripheral blood of all donors was detected by flow cytometry(FCM).The production of soluble CD28 in serum was detected using the skills of enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).ResultsThe percentage of CD4+CD28+and CD8+CD28+T cells in peripheral blood of patients from experiment group were respectively(23.367±8.562)%and(10.156±3.114)%,and were declined markedly compared with that of control group[(30.786±5.143)%and(17.200±3.624)%,respectively](P＜0.0.5,P＜0.0.1). In addition,compared with control group[(0.53±0.23)μg/L],the level of soluble CD28 was increased significantly in serum ofexperimentgroup[(2.35±0.58)μg/L](P＜0.01).ConclusionThe costimulatorymolecule CD28maybe take part in the immunological pathogenesismechanism of GD.

Membrane type CD28;Soluble CD28;Graves′disease

R581.11

A

1673-7210（2012）11（b）-0018-03

國家自然科學基金（30801023）。

王鳳鳴（1978-），女，江蘇常州人，醫(yī)學博士，助理研究員；研究方向：共刺激分子。

2012-07-04 本文編輯：谷俊英）