陳 慧 胡義珍 柯曉云 陳曉虹

流行病學(xué)研究表明原發(fā)性青光眼患者男∶女為1.00∶1.01，其中，原發(fā)性閉角型青光眼患者男∶女為1.00∶1.53，而原發(fā)性開角型青光眼(primary open-angle glaucoma，POAG)男 ∶ 女 為 2.55∶1.00[1]。這種差異的存在提示POAG發(fā)病與性激素可能存在一定的關(guān)系。Agapova等[2]發(fā)現(xiàn)雄激素可能與青光眼發(fā)病有重要聯(lián)系。眼是性激素作用的靶器官，睪酮在POAG的發(fā)病過程中是否起到一定的作用，是本次研究的重點(diǎn)之一。已有研究證明組織型谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶(tissue transglutaminase，tTG)與POAG發(fā)病密切相關(guān)[3-6]。那么，雄激素的存在，是否可以通過上調(diào)tTG在小梁細(xì)胞中的表達(dá)，從而在POAG的發(fā)展過程中起作用，是本次實(shí)驗(yàn)的研究重點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料 新生牛眼球來自武漢市牛羊加工廠，2 h內(nèi)用冰瓶運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。胎牛血清(Hyclone公司)，DMEM+F12培養(yǎng)基(Gibco公司)，鼠抗人Ⅳ型膠原蛋白、鼠抗人纖維連接蛋白、鼠抗人層粘連蛋白(Gibco公司)，鼠抗人tTG(美國Labvision公司)，SP二抗試劑盒(福州邁新公司)，睪酮注射液(天津金耀氨基酸有限公司)，Trizol試劑(Sigma公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO公司)，引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 牛眼小梁細(xì)胞的體外培養(yǎng)及鑒定 在超凈臺(tái)內(nèi)剪去眼周圍的筋膜組織后，將其浸泡于0.2×10－6g·L－1氧氰化汞 +4000 U·mL－1慶大霉素的水溶液中30 min。D-Hanks液沖洗眼球3次后，顯微鏡下分離取出小梁組織切成1 mm×2 mm的碎塊，均勻地貼于培養(yǎng)瓶的瓶底。將培養(yǎng)瓶在37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2恒溫箱內(nèi)倒置3 h后，待組織塊貼壁微干后，加入體積分?jǐn)?shù)20%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液適量。將培養(yǎng)瓶放入37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2恒溫箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。小梁細(xì)胞游離出組織塊后，每周換液2次。等細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶瓶底時(shí)，即達(dá)到匯合后，用2.5 g·L－1胰蛋白酶消化后按1∶2的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。制作細(xì)胞爬片并行Wright染色及免疫組織化學(xué)鑒定。

1.2.2 加入藥物誘導(dǎo) 將細(xì)胞分為5組。將睪酮用無水乙醇溶解后配成濃縮液，將這5組細(xì)胞的培養(yǎng)液吸凈并用D-hanks洗2次，加入不含血清的培養(yǎng)液，再分別加入18 ×10－3mmol·L－1、36 ×10－3mmol·L－1、54 ×10－3mmol·L－1、72 ×10－3mmol·L－1的睪酮，放入37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24 h;正常對(duì)照組不加睪酮。

1.2.3 RT-PCR法檢測(cè)不同濃度睪酮作用后tTG在牛眼小梁細(xì)胞的表達(dá)情況 取第3代近融合的牛眼小梁細(xì)胞(bovine trabecular meshwork cells，BTMC)(每培養(yǎng)瓶大約1×106個(gè)細(xì)胞)采用Trizol試劑盒(美國MRC公司產(chǎn)品)提取總RNA后。采用TOYOBO公司生產(chǎn)的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒完成逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)牛tTG特異性引物并合成(上海生工生物技術(shù)有限公司合成)。tTG引物序列:上游:5’-GTTCCAGTTCGTGCCATCA-3’，下游:5’-CCCTGTCTCCTCCTTCTCG-3’，擴(kuò)增后片段長度為433 bp。內(nèi)參擴(kuò)增引物序列:上游:5’-GTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3’，下游:5’-GACTGCTGTCACCTTCAOCGT-3’，擴(kuò)增片斷長度為212 bp。取cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR循環(huán)參數(shù):94℃變性1 min，52.4℃退火40 s，72℃引物延伸1 min，循環(huán)40次。取9 μL RT-PCR產(chǎn)物與1 μL上樣緩沖液充分混合后，點(diǎn)樣于20 g·L－1瓊脂糖凝膠中電泳20～30 min，紫外透射儀上觀察并照相。用凝膠圖像分析儀攝片，以內(nèi)參照作為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)各泳道進(jìn)行相對(duì)積分值的測(cè)定，半定量法比較各實(shí)驗(yàn)組tTG mRNA相對(duì)含量。

1.2.4 Western blotting測(cè)定不同濃度睪酮作用后BTMC中tTG蛋白的表達(dá) 收集各組培養(yǎng)細(xì)胞，溶于RIPA裂解液中，Ep管冰上操作，反復(fù)吹打后，置4℃冰箱10 min，取出于4℃ 12 000 r·min－1離心30 min，吸出上清液，總蛋白濃度的測(cè)定采用 Bradford方法測(cè)定，BSA作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度梯度。取等量蛋白40 μg，經(jīng) SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉液封閉，按照說明書比例用封閉液稀釋一抗和二抗，在孵育袋中孵育一抗4℃過夜，取出用TBST洗膜3次，每次5 min，再在孵育袋中孵育二抗，37℃ 1.5 h。ECL發(fā)光法顯色:將ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒中A、B兩種液體按照1∶1混合，淋于NC膜上，在暗室內(nèi)可見蛋白質(zhì)條帶發(fā)出綠色熒光，曝光于Kodak底片上，洗片。掃描結(jié)果以美國Kodak dslD系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，分析組間表達(dá)差異性，α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR結(jié)果 以β-actin為內(nèi)參照，計(jì)算各泳道相對(duì)積分光密度值。當(dāng)睪酮濃度為18×10－3mmol·L－1、36 × 10－3mmol·L－1、54 × 10－3mmol·L－1、72 ×10－3mmol·L－1時(shí)，其相對(duì)積分光密度值分別為 1.461 ± 0.021、2.111 ± 0.016、2.536 ±0.032、3.176 ±0.026，正常對(duì)照組為 1.487 ±0.013(圖1)。各組間tTG表達(dá)水平存在差異，隨著睪酮濃度的增加tTG表達(dá)水平也相應(yīng)增加，BTMC內(nèi)tTG mRNA水平呈睪酮濃度依賴性。

2.2 Western blotting結(jié)果 所測(cè)結(jié)果顯示，在未受睪酮刺激的小梁細(xì)胞中，tTG蛋白幾乎不表達(dá)，或處于一種失活狀態(tài)，而當(dāng)睪酮濃度達(dá)到72×10－3mmol·L－1時(shí)，小梁細(xì)胞tTG蛋白的表達(dá)明顯增加(圖2)。

RT-PCR與Western blotting的結(jié)果顯示，tTG在正常情況下存在于小梁細(xì)胞內(nèi)，但是表達(dá)甚少，通過雄激素睪酮刺激后，tTG不僅在基因水平表達(dá)增加，而且蛋白水平表達(dá)也有增強(qiáng)。

Figure 1 tTG in BTMC showed significant difference in mRNA level treated with different concentrations of testosterone.β-actin was set as control，and the relative integrated value of each line was calculated.N:Normal control group;T1:18 ×10－3mmol·L－1testosterone group;T2:36×10－3mmol·L－1testosterone group;T3:54 ×10－3 mmol·L－1testosterone group;T4:72 ×10 －3mmol·L－1testosterone group.There was no statistical difference between group N and T1，but there were significant differences between group N and group T2，T3，T4(all P＜0.05) 經(jīng)不同濃度睪酮刺激后的BTMC內(nèi)tTG mRNA水平表現(xiàn)出明顯的差異性，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算各泳道相對(duì)積分光密度值。N:正常對(duì)照組;T1:睪酮濃度18×10－3mmol·L－1;T2:睪酮濃度 36 ×10－3mmol·L－1;T3:睪酮濃度54 ×10－3mmol·L－1;T4:睪酮濃度72 ×10－3mmol·L－1。N組與T1組間不存在差異性，但N組與T2、T3、T4組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0.05)

Figure 2 Effects of testosterone with different concentrations on tTG expression in BTMC.N:Normal control group;T1:18 ×10 －3mmol·L－1testosterone group;T2:36 × 10－3mmol·L－1testosterone group;T3:54×10－3mmol·L－1testosterone group;T4:72 ×10－3 mmol·L－1testosterone group.The expression of tTG was changed with the obviously concentration dependant manner 不同濃度睪酮對(duì)BTMC內(nèi)tTG蛋白表達(dá)水平的影響。N:正常對(duì)照組;T1:睪酮濃度18 ×10－3mmol·L－1;T2:睪酮濃度36 ×10－3mmol·L－1;T3:睪酮濃度 54 ×10－3mmol·L－1;T4:睪酮濃度 72 ×10－3 mmol·L－1。結(jié)果顯示tTG蛋白表達(dá)水平隨著睪酮濃度變化而變化，具有明顯濃度依賴性

3 討論

本實(shí)驗(yàn)用不同濃度的睪酮刺激BTMC，發(fā)現(xiàn)隨著雄激素睪酮濃度的增加，BTMC中tTG的表達(dá)也隨之增加。說明雄激素睪酮對(duì)tTG表達(dá)的作用有濃度依賴性。

Tovar-Vidales等[6]報(bào)道青光眼患者小梁細(xì)胞中tTG的表達(dá)明顯高于正常人群。tTG釋放到細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)中，并發(fā)揮其蛋白交聯(lián)作用，使ECM蛋白交聯(lián)并抵抗降解，其作用底物有纖維連結(jié)蛋白、層粘連蛋白、Ⅲ型膠原、vitronectin等，因而造成ECM堆積[7]。由于tTG的增加使得ECM發(fā)生堆積，最早人們將這些沉積物描述為“斑塊樣物質(zhì)”(SD斑)[8]，隨著SD斑形成增多，最終導(dǎo)致小梁網(wǎng)和Schlemm管發(fā)生狹窄甚至堵塞，使房水外流阻力增加，眼壓增高。另外，金屬蛋白酶(MMP)是一類鋅離子依賴性內(nèi)源性蛋白水解酶，主要功能是降解ECM和基底膜，而tTG可優(yōu)先結(jié)合MMP-2的激活物，使MMP-2生成下降[9]。MMP的減少使得ECM降解減少，也有可能導(dǎo)致房水外流阻力的增加[10]。郝風(fēng)芹等[11]用RT-PCR的方法檢測(cè)BTMC中性激素受體蛋白mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示BTMC有性激素受體表達(dá)。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)我們可以推斷睪酮可能上調(diào)tTG的表達(dá)活性，一方面睪酮可能通過激素受體作用，使得tTG合成增加，另一方面睪酮可能與細(xì)胞膜表面的雄激素受體結(jié)合，開放Ca2+通道，使得細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加，更多的Ca2+與tTG結(jié)合而使這種酶激活發(fā)揮作用。睪酮使tTG合成增加，tTG活化，進(jìn)而tTG表達(dá)上調(diào)，通過tTG的作用，從而使得ECM中蛋白交聯(lián)而不容易發(fā)生降解，導(dǎo)致小梁細(xì)胞的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使得房水流出阻力增加。當(dāng)然睪酮的作用機(jī)制是多方面的，而 tTG也受很多途徑調(diào)節(jié)，例如 Tovar-Vidales等[12]提出的轉(zhuǎn)化生長因子-β2也調(diào)節(jié)tTG的表達(dá)，所以實(shí)驗(yàn)中睪酮與tTG表達(dá)上調(diào)并不是完全平行的曲線。

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