李 印 李 拓 宋秀勝 李家璋 吳青松 李紅艷 賀 濤

CD157是一種相對(duì)分子質(zhì)量為42 000～45 000的細(xì)胞膜表面分子，通過(guò)糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidyl inositol，GPI)錨著于細(xì)胞膜上，稱為GPI錨定蛋白，它們沒(méi)有跨膜區(qū)與胞內(nèi)部分，不能直接與胞內(nèi)發(fā)生聯(lián)系。但用特異性抗體與這些結(jié)構(gòu)上不同的膜蛋白或膜糖鞘脂結(jié)合后，卻能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)，介導(dǎo)細(xì)胞的黏附和遷移及參與免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)[1]。雖然CD157沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)，但具有受體功能，向細(xì)胞內(nèi)傳遞信號(hào)，這個(gè)功能可用抗CD157的單克隆抗體作為天然配體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[2]。視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細(xì)胞是增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(proliferative vitreoretinopathy，PVR)的主要細(xì)胞成分，RPE細(xì)胞的遷移、黏附和增生是PVR形成的最重要的機(jī)制。許多眼科疾病的發(fā)生都與RPE細(xì)胞的遷移、黏附有關(guān)。為研究RPE細(xì)胞的遷移和黏附作用是否與CD157有關(guān)，我們采用免疫組織化學(xué)、Western-blot、RT-PCR檢測(cè)ARPE-19細(xì)胞中CD157的表達(dá)，并用CD157單克隆抗體刺激細(xì)胞，檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞的遷移和黏附功能的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 ARPE-19細(xì)胞系、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)(武漢大學(xué)細(xì)胞庫(kù)，CCTCC)，DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司)，Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(加拿大Fermentas公司)，PCR擴(kuò)增試劑(加拿大Fermentas公司)，RIPA細(xì)胞裂解液(北京普利萊基因技術(shù)公司)，CD157鼠抗人單克隆抗體(SY/11B5)(美國(guó)eBioscience公司)，βactin鼠抗(武漢博士德生物工程有限公司)，人纖連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)(以色列，Prospec公司)，山羊抗鼠SABC試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色 將無(wú)菌的蓋玻片置入培養(yǎng)板中，將ARPE-19細(xì)胞接種于蓋玻片上，置于37℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜。撈出蓋玻片，PBS漂洗，冰丙酮固定15 min，晾干，體積分?jǐn)?shù)3%H2O2室溫孵育15 min，PBS清洗，吸去 PBS，在玻片上滴加50 g·L－1BSA，室溫封閉30 min，實(shí)驗(yàn)組滴加1∶100稀釋的鼠抗人CD157一抗并放入濕盒，陰性對(duì)照組滴加鼠血清IgG，4℃孵育過(guò)夜;滴加生物素化二抗(羊抗鼠)37℃孵育25 min，PBS沖洗，滴加SABC復(fù)合物，37℃孵育25 min。每張爬片滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡(Nikon E100)下觀察，陽(yáng)性信號(hào)為棕黃色或棕褐色染色。

1.2.2 Western-blot檢測(cè)細(xì)胞中 CD157 蛋白的表達(dá) 取培養(yǎng)的ARPE-19細(xì)胞(實(shí)驗(yàn)組)及HUVEC(陽(yáng)性對(duì)照組)，棄培養(yǎng)液，PBS洗滌后加RIPA細(xì)胞裂解液刮取細(xì)胞，并超聲裂解，蛋白定量，120 g·L－1SDS-PAGE蛋白電泳，轉(zhuǎn)膜，50 g·L－1脫脂奶粉的封閉液室溫?fù)u床封閉2 h，1∶500稀釋的一抗孵育液浸泡PVDF膜，4℃孵育過(guò)夜，1∶20 000稀釋羊抗鼠HRP二抗孵育，室溫?fù)u床孵育2 h，發(fā)光試劑盒(ECL)發(fā)光，曝片。

1.2.3 RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中CD157 mRNA的表達(dá)采用Trizol試劑提取ARPE-19細(xì)胞總RNA，實(shí)驗(yàn)步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，取2 μg總RNA用Oligo-dT引物擴(kuò)增cDNA文庫(kù)，取2 μL cDNA產(chǎn)物做逆轉(zhuǎn)錄 PCR反應(yīng)模板。CD157引物(上游引物:5’-CGATTACCAATCCTGCCCTA-3’，下游引物:5’-TTTGATGGGATAGGCTCCTG-3’，154 bp)、β-actin 引物(上游引物:5’-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3’，下游引物:5’-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3’，240 bp)?？偭?5 μL的PCR反應(yīng)體系如下:10 ×PCR緩沖液 2.5 μL，25 μmol·L－1MgCl21.5 μL，2.5 μmol·L－1dNTP 2.0 μL，Taq 酶0.5 μL，上下游引物(10 μmol·L－1)各 0.5 μL，剩余用水補(bǔ)足。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性4 min，開(kāi)始循環(huán):94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸25 s，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸4 min。PCR產(chǎn)物及PCR-Marker在含溴化乙錠(EB)的10 g·L－1瓊脂糖凝膠中電泳，紫外燈上觀察并照相，β-actin作為內(nèi)對(duì)照。

1.3 CD157對(duì)RPE細(xì)胞遷移及黏附的影響

1.3.1 Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)1%FBS的DMEM/F12重懸，計(jì)數(shù)。取ARPE-19細(xì)胞(每孔50×103個(gè)細(xì)胞)分別加入10 mg·L－1鼠抗人 CD157抗體(實(shí)驗(yàn)組)或 β-actin鼠抗(對(duì)照組)室溫處理20 min。在Transwell小室的下層加入400 μL含體積分?jǐn)?shù)10%FBS的 DMEM/F12培養(yǎng)基，然后蓋上8 μm的微孔多聚碳酸酯濾膜，將處理后的細(xì)胞加入Transwell小室內(nèi)，置37℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h。取出Transwell小室，小心擦去內(nèi)側(cè)膜上的細(xì)胞，外側(cè)細(xì)胞結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下每張膜隨機(jī)觀察5個(gè)視野并計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.2 Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞黏附能力 細(xì)胞傳代、計(jì)數(shù)，取100×103個(gè) ARPE-19細(xì)胞分別加入CD157抗體(實(shí)驗(yàn)組)和β-actin鼠抗(對(duì)照組)，終濃度為10 mg·L－1，室溫處理20 min后種植于FN(10 mg·L－1)包被的24孔板中，置37℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2溫箱孵育1 h后PBS沖洗掉未被黏附的細(xì)胞，黏附的細(xì)胞用40 g·L－1多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，顯微鏡下每孔任選5個(gè)視野計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 本研究采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)中計(jì)量資料用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD157在RPE細(xì)胞中的表達(dá) 通過(guò)免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組ARPE-19細(xì)胞表面有著色，胞核及胞質(zhì)中未見(jiàn)顯色(圖1)，陰性對(duì)照組細(xì)胞表面及胞質(zhì)、胞核均未見(jiàn)著色(圖2)。Western-blot檢測(cè)ARPE-19細(xì)胞(實(shí)驗(yàn)組)及HUVEC/CD157+(陽(yáng)性對(duì)照組)中均有CD157表達(dá)(圖3)，RT-PCR也可證實(shí)RPE細(xì)胞中有CD157的表達(dá)(圖4)。

2.2 CD157抑制ARPE-19細(xì)胞的遷移 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組遷移細(xì)胞數(shù)見(jiàn)表1，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.759，P ＜0.05)，表明CD157 可抑制 ARPE-19細(xì)胞的遷移。

Figure 1 Immunohistochemistry showed the surface of ARPE-19 cells was dyed，but no dyed in nucleus or cytoplasm in experiment group(×400) 實(shí)驗(yàn)組ARPE-19細(xì)胞表面有著色，胞核及胞質(zhì)中未見(jiàn)顯色(×400)

Figure 2 Cells surface，cytoplasm and nuclei was not stained in negative control group(×400) 陰性對(duì)照組細(xì)胞表面及胞質(zhì)、胞核均未見(jiàn)著色(×400)

Figure 3 CD157 expression was detected by Western-blot both in ARPE-19 cell(experiment group)and HUVEC(positive control group)Western-blot檢測(cè)ARPE-19細(xì)胞(實(shí)驗(yàn)組)及HUVEC/CD157+(陽(yáng)性對(duì)照組)中均有CD157表達(dá)

表1 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù)比較Table 1 Comparison of migrative cells between experimental group and control group(±s)

表1 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù)比較Table 1 Comparison of migrative cells between experimental group and control group(±s)

Group Experiment 1 Experiment 2 Experiment 3 Experiment 203±36 219±42 225±37 Control 384±46 357±38 362±57

2.3 CD157抑制 RPE細(xì)胞的黏附 實(shí)驗(yàn)組(CD157抗體)與對(duì)照組(β-actin鼠抗)黏附的細(xì)胞數(shù)見(jiàn)表2，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=14.370，P＜0.05)。表明CD157具有抑制RPE細(xì)胞黏附的功能。

Figure 4 RT-PCR showed CD157(154 bp)expression RT-PCR結(jié)果顯示CD157(154 bp)表達(dá)

表2 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組黏附細(xì)胞數(shù)比較Table 2 Comparison of adhesive cells between experimental group and control group(±s)

表2 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組黏附細(xì)胞數(shù)比較Table 2 Comparison of adhesive cells between experimental group and control group(±s)

Group Experiment 1 Experiment 2 Experiment 3 Experiment 222±20 243±34 237±26 Control 330±56 353±44 347±38

3 討論

人類CD157又名為骨髓基質(zhì)細(xì)胞抗原 (bone marrow stromal cell antigen 1，BST-1)或髓系抗原Mo5，是一個(gè)含有318個(gè)氨基酸信號(hào)序列的單鏈細(xì)胞表面糖蛋白，人類與鼠的CD157分子氨基酸序列有72%的一致性[3]。作為一種GPI錨定蛋白，COOH-端是主要錨著位點(diǎn)。CD157的氨基酸序列完全位于細(xì)胞外而無(wú)任何跨膜區(qū)或胞內(nèi)部分，接近細(xì)胞膜表面的COOH-端為疏水區(qū)，末梢部的NH2-端含有催化域[4]。CD157同時(shí)具有ADP核糖基環(huán)化酶、cADPR水解酶兩種胞外酶(次要作用)和細(xì)胞表面受體功能(主要作用)的雙重特性。作為胞外酶，CD157屬于CD38分子家族，其在蛋白構(gòu)成上有36%的氨基酸序列一致性，但是CD157和CD38的組織分布截然不同，可表達(dá)于骨髓基質(zhì)細(xì)胞、間皮細(xì)胞、臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞等多種類型的細(xì)胞上，但不表達(dá)在腦組織中[5]。其表達(dá)在角膜緣干細(xì)胞和角膜基質(zhì)細(xì)胞上可發(fā)揮受體作用的功能[6]。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)腔滑液中也有CD157的表達(dá)，并被認(rèn)為是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的致病因子[7]。CD157在卵巢癌細(xì)胞的黏附、遷移及向腹膜侵襲過(guò)程中起著不可或缺的作用[8]。參與調(diào)節(jié)體液免疫反應(yīng)[9]及白血球聚集[10]，是中性粒細(xì)胞黏附和跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移中起關(guān)鍵作用的分子[11-12]。

目前，尚無(wú)文獻(xiàn)研究CD157在RPE細(xì)胞中的作用，為了解在RPE細(xì)胞中有無(wú)CD157的表達(dá)及其作用，本實(shí)驗(yàn)免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示:ARPE-19細(xì)胞表面有顯色，而胞核與胞質(zhì)均無(wú)著色，提示細(xì)胞表面有CD157的表達(dá);Western-blot結(jié)果提示ARPE-19細(xì)胞中有CD157蛋白的表達(dá);RT-PCR也證實(shí)了ARPE-19細(xì)胞有CD157的轉(zhuǎn)錄。以上各方法均能證實(shí)ARPE-19細(xì)胞中有CD157的表達(dá)，并通過(guò)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究CD157在RPE細(xì)胞中的作用。RPE細(xì)胞的移行被認(rèn)為是 PVR等疾病發(fā)生的重要起始階段。RPE從原位游離出來(lái)，離開(kāi)原有的微環(huán)境后，形態(tài)和功能上發(fā)生了很大變化，細(xì)胞開(kāi)始失去它原來(lái)的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，由靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛钴S狀態(tài)，當(dāng)接觸到網(wǎng)狀的玻璃體纖維或到達(dá)視網(wǎng)膜表面時(shí)開(kāi)始增生，合成細(xì)胞外基質(zhì)。由整合素介導(dǎo)的RPE細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白以及RPE細(xì)胞之間的黏附則涉及PVR的形成[13]。而CD157可募集整合素等跨膜分子形成大分子復(fù)合物，構(gòu)成分子搭檔參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及遷移和黏附功能[14]。

目前，對(duì)某一細(xì)胞受體或表面分子在其自然配體未找到之前，均用其特導(dǎo)抗體結(jié)合該分子以模擬配體、受體之間的結(jié)合，來(lái)研究其介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或功能，但這種方式在何種程度上真正模擬了配體、受體之間的自然結(jié)合并不清楚。根據(jù)Funaro等[12]和Lo Buono等[14]對(duì)CD157的相關(guān)研究，我們發(fā)現(xiàn)用10 mg·L－1CD157單克隆抗體處理ARPE-19細(xì)胞20 min后，細(xì)胞的遷移和黏附能力明顯減弱，說(shuō)明CD157可抑制ARPE-19細(xì)胞的遷移和黏附，但是與對(duì)照組相比，并沒(méi)有因?yàn)榇碳ち薈D157后徹底降低，提示在ARPE-19細(xì)胞的遷移和黏附過(guò)程中，CD157的表達(dá)起部分作用或與某些分子起著聯(lián)合作用，但還存在其他的未知因素起部分作用，需要進(jìn)一步研究。

CD157是一種錨定蛋白，位于胞外而無(wú)跨膜區(qū)或胞內(nèi)結(jié)構(gòu)介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，需借助與其結(jié)合的相關(guān)分子(自然配體、特異抗體等)幫助胞外信號(hào)向胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CD157的表達(dá)是ARPE-19細(xì)胞遷移、黏附的主要機(jī)制之一，可能在PVR發(fā)生發(fā)展中起著不可或缺的作用。但其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路仍待繼續(xù)研究。

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