許 菲

（蚌埠市第三人民醫(yī)院，安徽 蚌埠 233000）

心律失常為心血管病中的常見疾病，包括慢性心律失常和快速性心律失常。目前，很多治療心律失常藥物的作用機制是通過影響心肌細胞膜上各種離子通道的活性狀態(tài)而實現(xiàn)的［1，2］。有文獻報道［3，4］，α腎上腺素受體激動劑有可能導致心律失常，而作為α腎上腺素受體阻斷劑的甲磺酸酚妥拉明（Phentolamine Mesylate，PM）或許會抑制此作用，故本實驗采用膜片鉗全細胞記錄技術研究PM對正常大鼠心室肌細胞膜鈉離子通道電流的影響［5，6］，進而了解PM是否有抗心律失常作用。

1 材料

1.1 動物

選取體質(zhì)量為200～250g的9～10周齡的SD大鼠（雌雄不限），由蚌埠醫(yī)學院實驗動物中心提供。

1.2 試藥和儀器

實驗藥物：PM購自上海旭東海普藥業(yè)有限公司。試劑：膠原酶Ⅰ型，購自Sigma公司，批號：No232－582－9。儀器：倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；膜片鉗放大器（EPC－9，德國）；微電極拉制器（NARISHIGE，日本）；液壓微電極推進器（NARISHIGE，日本）；顯微鏡攝像機（日本JVC公司）；模數(shù)／數(shù)模轉(zhuǎn)化器（Digitata1200A／B，美國AXON公司）；恒溫水浴箱（DR－HW－1型，北京）；心肌細胞封接監(jiān)視器（SONY SSN，日本）；記錄分析軟件（Patch Clamp 6.01，美國AXON公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 細胞分離

單個心室肌細胞是采用酶解的方法進行分離。用苯巴比妥鈉（30mg／kg i.p）麻醉后，立即開胸取出心臟，置于2℃的無Ca2＋臺氏液中，心臟經(jīng)修飾后固定在Langendorff灌流架上，用無Ca2＋臺式液經(jīng)主動脈根部逆灌流5min，用含膠原酶I及0.2%牛血清蛋白的無Ca2＋臺氏液反復灌流12 min，至心臟膨大出現(xiàn)拉絲后從灌流裝置上取下，剪成小塊，吸管反復吹打，最后吸取上清液保存在KB液中備用。

2.2 細胞封接與全細胞記錄模式的形成

取上述保存的心室肌細胞上層懸液數(shù)滴，滴于細胞池中，選取表面光潔、橫紋清晰的心肌細胞為研究對象。使用液壓微操縱器將電極靠近細胞進行封接，吸破細胞膜，補償電容電流和電極串聯(lián)電阻，形成全細胞記錄模式。在使用10－5mmol／L PM干預前（對照）和干預后分別記錄INa激活（電流－電壓）、穩(wěn)態(tài)失活、失活后再恢復刺激程序下的電流。實驗中脈沖信號由Patch Clamp 6.01軟件控制，通道信號經(jīng)EPC－9膜片鉗放大器放大，通過Ag－AgCl電極絲和填充電極內(nèi)液的微電極導入細胞，產(chǎn)生的電流信號經(jīng)EPC－9轉(zhuǎn)換，為Patch Clamp 6.01軟件收集和分析。

2.3 統(tǒng)計學處理

統(tǒng)計學處理由計算機通過Patch Clamp 6.01軟件控制采集數(shù)據(jù)，用配對t檢驗進行統(tǒng)計學分析，計量數(shù)據(jù)均用（）表示，P＜0.05提示有顯著統(tǒng)計學意義。

3 INa電流的記錄

3.1 INa電流－電壓曲線（I－V曲線）

維持電位在－80mV，階躍＋10mV，逐步去極化至＋50mV，刺激頻率1Hz，鉗制時間60ms。為了消除細胞間因體積差異而造成的誤差，電流值以電流密度（pA／pF）表示，將不同鉗制電壓下的INa電流密度繪成I－V曲線。觀察10－5mmol／L PM干預組對大鼠心室肌細胞INa I－V曲線的影響。結(jié)果如圖1所示，兩組細胞INa的I－V曲線，在近－70mV激活，－40mV達峰值，＋50mV時反轉(zhuǎn)。PM干預組與對照組相比，I－V曲線明顯上移，且對照組和10－5mmol／L PM干預組的INa電流密度峰值分別為（－39.87±1.28）pA／pF（n＝8）和（－17.31±0.33）pA／pF（n＝8），PM 干預組較對照組INa電流密度峰值明顯下降（P＜0.05）。但INa的電壓依賴性趨勢未發(fā)生改變，其反轉(zhuǎn)電位、峰值電位、激活電位及I－V曲線的形態(tài)軌跡無明顯影響。

圖1 10－5mmol／L PM干預組和對照組的I－V曲線

3.2 INa穩(wěn)態(tài)失活曲線

維持電位＝－80mV，條件脈沖－160mV～－50mV，鉗制時間100ms，階躍＋10mV，每次條件脈沖后緊跟一固定的去極化到－40mV的測試脈沖，持續(xù)時間25ms，以INa與最大激活時的INa的比值與對應條件脈沖膜電位作圖得到鈉通道失活曲線。觀察10－5mmol／L PM干預組與對大鼠心室肌細胞INa電壓依賴性穩(wěn)態(tài)失活曲線的變化。結(jié)果如圖2所示，PM干預組與對照組相比，INa電壓依賴性穩(wěn)態(tài)失活曲線明顯向超極化方向移動。

3.3 INa失活后再恢復曲線

采用雙脈沖刺激法，第一個脈沖維持電位為－80mV，去極化至－30mV，持續(xù)50ms，在第1個脈沖回到維持電位后給予第2個脈沖去極化至－40mV，持續(xù)30ms，第1個脈沖和第2個脈沖間隔時間依次是10ms、20ms、30ms，逐級遞增至150ms。第1個脈沖和第2個脈沖的INa之比與相應的間隔時間作圖，得鈉通道失活后再恢復過程曲線。觀察PM對失活后再恢復過程的影響。由圖3可知，PM干預組INa失活后再恢復明顯減慢，再恢復時間延長。

圖2 10－5mmol／L PM干預組和對照組的INa穩(wěn)態(tài)失活曲線

圖3 10－5mmol／L PM干預組和對照組的INa失活后再恢復曲線

4 結(jié)論

本實驗結(jié)果表明PM能降低正常心室肌細胞INa電流密度峰值，能使INa通道失活加速，失活后再恢復時間延遲；這些現(xiàn)象表明PM可以使心室肌細胞動作電位0相上升速率減慢，使心肌細胞間傳導減慢，心肌細胞的興奮性降低，使折返激動不易形成，從而可以降低快速性室性心律失常的發(fā)生率。

［1］ 戴德哉.嚴重心律失常的相關離子通道病及分子機制探討［J］.生命科學，2008，20（1）：69－72.

［2］ 潘建紅，姚民強，王佩顯.原發(fā)性心電疾病的研究進展［J］.中國心血管雜志，2010，15（5）：403－405.

［3］ SHANNON R，CHAUDHRY M，et al.Effect of alpha1－adrenergic receptors in cardiac pathophysiology［J］.American Heart Journal，2006，152（5）：842－850.

［4］ KURZ T，YZMADA KA，et al.Alpha1－adrenergic systermand arrhythmias in ischaemic heart disease［J］.Eur Heart J，1991，12（2）：88－98.

［5］ 李媛，劉善文，李華榮，等.嚴重心律失常的相關離子通道病及分子機制探討［J］.中國藥理學通報，2011，27（9）：1205－1209.

［6］ 巫少榮，李自成，余健，等.大蒜素對心肌室細胞膜鈉通道電流的影響［J］.中國病理學雜志，2011，27（4）：658－661.