劉 云，包瓊瓊，莊曉賽，胡 喬，孫妙璇，周莉莉，張 雄

(溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，浙江溫州 325027)

梓醇是地黃中提取的單體活性成分，具有抗癌、抗炎、利尿和降血糖等多種生物學(xué)活性。近幾年來(lái)，梓醇在神經(jīng)保護(hù)尤其是神經(jīng)退行性疾病方面的作用受到越來(lái)越多的關(guān)注。據(jù)報(bào)道，梓醇能夠改善1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropypridine，MPTP)和魚(yú)藤酮導(dǎo)致的中腦細(xì)胞元損傷［1－3］、改善過(guò)氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞的損傷［4－5］以及改善淀粉樣β蛋白片段25－35(amyloidβprotein fragment 25 －35，Aβ25–35)誘導(dǎo)的認(rèn)知功能障礙［6］。帕金森病(Parkinson disease，PD)是我國(guó)第二大神經(jīng)退行性疾病，證據(jù)顯示PD發(fā)病率在65歲以上的老年人約為1.7%［7］。盡管PD具體的病因復(fù)雜而且不明確，但是目前泛素-蛋白酶體功能障礙在PD發(fā)病中的作用已得到廣泛認(rèn)可［8］。研究表明，20S蛋白酶體抑制劑導(dǎo)致的蛋白酶體功能障礙是導(dǎo)致中腦多巴胺(dopamine，DA)神經(jīng)元變性的主要原因［9－10］。因此能夠改善細(xì)胞內(nèi)20S蛋白酶體含量和功能的藥物可以選擇作為PD治療的潛在藥物。

乳胞素可抑制20S蛋白酶體多種肽酶的活性，是建立蛋白酶體功能障礙性PD模型的公認(rèn)藥物［11］。SH-SY5Y細(xì)胞是國(guó)內(nèi)外研究 PD的常見(jiàn)細(xì)胞模型［12］。梓醇雖具有多重神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)功能［13］，但目前對(duì)于梓醇在蛋白酶體功能障礙方面的影響還鮮有報(bào)道。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方地黃能夠拮抗6-羥基多巴胺誘導(dǎo)的PD大鼠模型中黑質(zhì)DA能神經(jīng)元的丟失，發(fā)揮對(duì)DA神經(jīng)元的保護(hù)功能(待發(fā)表)。本實(shí)驗(yàn)選用蛋白酶體抑制劑乳胞素誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞建立PD模型，探討梓醇在蛋白酶體功能障礙所致DA神經(jīng)元損傷中是否具有保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器

SH-SY5Y細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院;乳胞素購(gòu)自美國(guó)Alexis公司，純度≥97%;梓醇購(gòu)自上海同田公司，純度≥97%;RPMI1640培養(yǎng)基、0.05%胰蛋白酶-EDTA和噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司;FITC標(biāo)記膜蛋白碘化丙啶(Annexin-fluorescein isothiocyanate/propodium iodide，F(xiàn)ITC-AnnexinⅤ/PI)細(xì)胞凋亡試劑盒和 Hoechst染色試劑盒購(gòu)自南京凱基生物技術(shù)有限公司;人20S蛋白酶體定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自德國(guó)IBL公司。倒置顯微鏡為日本Nikon公司產(chǎn)品;熒光顯微鏡為日本Olympus公司產(chǎn)品;流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD公司產(chǎn)品;全自動(dòng)酶標(biāo)儀為美國(guó)Bio-Tek公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

SH-SY5Y細(xì)胞采用含有10%胎牛血清的R1640培養(yǎng)基，添加青霉素 100 kU·L－1、鏈霉素100 mg·L－1，置于恒溫 37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道［7－8］，及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)梓醇濃度10 μmol·L－1，干預(yù)時(shí)間為 1 h。

細(xì)胞分成正常對(duì)照組，不加任何藥物;乳胞素組加入乳胞素10μmol·L－1作用24 h;梓醇預(yù)處理組先加入梓醇10μmol·L－1預(yù)處理1 h后，再加入乳胞素10μmol·L－1繼續(xù)培養(yǎng)24 h;梓醇組加入梓醇10μmol·L－1單獨(dú)作用 1 h后完全培養(yǎng)繼續(xù)培養(yǎng)24 h;實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.3 觀察SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)改變

每組細(xì)胞相應(yīng)處理結(jié)束后，吸取培養(yǎng)板里培養(yǎng)液，用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，將細(xì)胞培養(yǎng)板放到倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率

細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液后接種到96孔板，按照每孔10 000個(gè)接種，設(shè)6個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞貼壁后按照實(shí)驗(yàn)分組給予藥物處理，處理結(jié)束后加入20μl MTT(5 g·L－1)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸掉培養(yǎng)液，加入二甲亞砜(DMSO)每孔150μl，搖床上輕輕振蕩10 min，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在波長(zhǎng)490 nm處檢測(cè)各組細(xì)胞的吸光度(absorbance，A)。為消除培養(yǎng)板和培養(yǎng)基對(duì)結(jié)果的影響，實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組。細(xì)胞存活率(%)=(A實(shí)驗(yàn)組－A空白組)/(A實(shí)驗(yàn)組－A空白組)×100%。

1.5 AnnexinⅤ-FITC流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率

細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，消化貼壁的SH-SY5Y細(xì)胞為單個(gè)細(xì)胞懸液，離心去上清，PBS洗滌計(jì)數(shù)細(xì)胞，收集(1～5)×105個(gè)細(xì)胞，離心去上清，加入緩沖液300μl重懸細(xì)胞，加入5μl AnnexinⅤ-FITC，將其混勻后加入5μl PI，室溫避光染色30 min后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率。凋亡率為計(jì)數(shù)1×104個(gè)細(xì)胞中凋亡細(xì)胞所占百分比。

1.6 Hoechst33258染色檢測(cè)細(xì)胞核形態(tài)變化

細(xì)胞接種密度為每孔(1～2)×104個(gè)，藥物處理結(jié)束后，加入0.5 ml固定液固定，PBS洗滌，加入0.5 ml Hoechst33258染色液避光反應(yīng)10 min，以紫外340 nm波長(zhǎng)激發(fā)，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核形態(tài)。正常細(xì)胞核出現(xiàn)彌漫均勻的低強(qiáng)度熒光，細(xì)胞核如呈濃染致密的固縮形態(tài)，記為凋亡的細(xì)胞，每組3張不同的玻片上各隨機(jī)選取4個(gè)視野計(jì)數(shù)，凋亡率(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.7 雙抗體包被法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)20S蛋白酶體含量

培養(yǎng)結(jié)束，消化SH-SY5Y細(xì)胞，離心，PBS重懸細(xì)胞密度為1×109L－1，反復(fù)凍融法裂解細(xì)胞，1040×g離心20 min，取上清液。每空加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100μl，每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔并設(shè)立空白對(duì)照孔，經(jīng)溫育、洗滌、酶標(biāo)、顯色后，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在450 nm下檢測(cè)A，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的A繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和待測(cè)樣品A計(jì)算出待測(cè)樣品中蛋白酶體含量(μg·L－1)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 梓醇對(duì)乳胞素誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)的影響

正常對(duì)照組和梓醇10μmol·L－1組細(xì)胞呈扁平多邊形，貼壁良好，細(xì)胞周邊有突起(圖1A，B);乳胞素10μmol·L－1組細(xì)胞胞體腫脹變圓變小，突起減少，周邊折光性增強(qiáng)(圖1C);梓醇10μmol·L－1預(yù)處理組較乳胞素10μmol·L－1組細(xì)胞突起增多，貼壁明顯改善及周邊折光性減弱(圖1D)。

Fig.1 Effect of catalpol on lactacystin-induced cell morphology changes in SH-SY5Y cells(×200).A:normal control group;B:catalpol 10 μmol·L －1 group;C:lactacystin 10 μmol·L －1 group;D:catalpol 10 μmol·L －1+lactacystin 10 μmol·L －1 group.

2.2 梓醇對(duì)乳胞素誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞存活的影響

梓醇10 μmol·L－1組細(xì)胞存活率為(99.7 ±3.0)%，與正常對(duì)照組相(100.0 ±2.5)%相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;乳胞素10 μmol·L－1組細(xì)胞存活率(72.0 ±1.8)%明顯下降(P ＜0.05);梓醇 10 μmol·L－1預(yù)處理組細(xì)胞存活率為(87.9±2.2)%，與乳胞素組相比明顯升高(P ＜0.05)。

2.3 梓醇對(duì)乳胞素誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡率的影響

流式細(xì)胞雙染結(jié)果(圖2)顯示，與正常對(duì)照組細(xì)胞凋亡率 (33.6±2.1)% 相比，乳胞素10 μmol·L－1組細(xì)胞凋亡率為(64.7 ±2.6)%，明顯增加(P ＜0.05);梓醇10 μmol·L－1預(yù)處理組細(xì)胞凋亡率為(51.4±1.5)%，與乳胞素組比較明顯下降(P ＜0.05)。

Fig.2 Effect of catalpol on lactacystin-induced cell apoptotic rate changes in SH-SY5Y cells.A:normal control group;B:catalpol 10 μmol·L －1 group;C:lactacystin 10 μmol·L －1 group;D:catalpol 10 μmol·L －1+lactacystin 10 μmol·L －1 group.

2.4 梓醇對(duì)乳胞素誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞核形態(tài)的影響

熒光顯微鏡下觀察SH-SY5Y細(xì)胞核形態(tài)發(fā)現(xiàn)，正常對(duì)照組與梓醇組細(xì)胞核邊緣光滑整齊，呈藍(lán)色，均勻淡染(圖 3A，B);乳胞素10 μmol·L－1組可見(jiàn)凋亡特征性改變，如細(xì)胞核固縮，邊緣不整齊，呈碎塊狀致密濃染，甚至可看核裂解(圖3C);與乳胞素10 μmol·L－1組比較，梓醇 10 μmol·L－1預(yù)處理組細(xì)胞核形態(tài)明顯改善，細(xì)胞核固縮裂解減少(圖3D)。與正常對(duì)照組細(xì)胞凋亡率(18.7±1.5)%相比，乳胞素10 μmol·L－1組細(xì)胞凋亡率為(48.5 ±2.3)%，明顯升高(P ＜0.05);梓醇10 μmol·L－1預(yù)處理組細(xì)胞凋亡率為(25.7±2.3)%，與乳胞素組相比較明顯降低(P ＜0.05)。

Fig.3 Effect of catalpol on lactacystin-induced nuclear morphology changes in SH-SY5Y cells(Hoechest33258 staining × 400).A:normal control group;B:catalpol 10 μmol·L－1 group;C:lactacystin 10 μmol·L －1 group;D:catalpol 10 μmol·L －1+lactacystin 10 μmol·L －1 group.

2.5 梓醇對(duì)乳胞素誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)20S蛋白酶體含量的影響

ELISA結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)20S蛋白酶體含量(58.2 ± 1.6)μg·L－1相比，乳胞素10 μmol·L－1組細(xì)胞內(nèi)蛋白酶體含量為(23.8 ±2.1)μg·L－1，明顯降低(n=3，P ＜0.05);與乳胞素10 μmol·L－1組相比，梓醇10 μmol·L－1預(yù)處理組細(xì)胞內(nèi)蛋白酶體含量為(42.2 ±2.2)μg·L－1，明顯升高(n=3，P ＜0.05)。

3 討論

有研究表明，在PD發(fā)病過(guò)程中存在細(xì)胞的凋亡，Agid等［14］檢測(cè)黑質(zhì)DA神經(jīng)元凋亡形態(tài)學(xué)和生化過(guò)程發(fā)現(xiàn)，在PD患者腦內(nèi)DA神經(jīng)元有細(xì)胞凋亡特征性改變，提示細(xì)胞凋亡可能是DA神經(jīng)元變性的基本步驟。據(jù)報(bào)道，地黃配成復(fù)方制劑對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡有明顯的抑制作用［15］。而梓醇是地黃中的主要活性成分，具有多種神經(jīng)保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)蛋白酶體抑制劑乳胞素處理后，SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡率增加以及細(xì)胞核固縮裂解增加;而低濃度梓醇預(yù)處理后再進(jìn)行乳胞素處理，細(xì)胞的形態(tài)得到改善、存活率升高和凋亡率下降及細(xì)胞核固縮裂解現(xiàn)象減少。提示梓醇能夠減少乳胞素誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡，發(fā)揮對(duì)乳胞素誘導(dǎo)的DA神經(jīng)元的保護(hù)功能。

泛素蛋白酶體是體內(nèi)蛋白降解的重要通道，在多種細(xì)胞周期性增殖及凋亡相關(guān)蛋白的降解中發(fā)揮重要作用。據(jù)報(bào)道，PD可能是一種蛋白降解障礙疾病［16］，并且在PD中泛素-蛋白酶體功能障礙與多巴胺能神經(jīng)元的凋亡存在密切的關(guān)系［17］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，單用乳胞素處理細(xì)胞24 h后，細(xì)胞內(nèi)蛋白酶體含量明顯下降，而低濃度梓醇預(yù)處理后能夠抑制乳胞素誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)蛋白酶體含量下降。推測(cè)梓醇的神經(jīng)保護(hù)可能與其提高細(xì)胞內(nèi)蛋白酶體含量有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，梓醇預(yù)處理后可以逆轉(zhuǎn)蛋白酶體抑制劑乳胞素誘導(dǎo)的DA神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡，并推測(cè)其機(jī)制可能與提高細(xì)胞內(nèi)蛋白酶體含量有關(guān)。首次從蛋白酶體途徑上說(shuō)明了梓醇的神經(jīng)保護(hù)作用，為梓醇在神經(jīng)退行性疾病PD的防治方面提供了有力的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。本次實(shí)驗(yàn)從對(duì)蛋白酶體含量的影響上展現(xiàn)了梓醇對(duì)DA神經(jīng)元的保護(hù)作用，其具體機(jī)制及其對(duì)蛋白酶體功能方面的影響將是本課題組下一步研究目標(biāo)。

［1］Xu G，Xiong Z，Yong Y，Wang Z，Ke Z，Xia Z，et al.Catalpol attenuates MPTPinduced neuronal degeneration of nigral-striatal dopaminergic pathway in mice through elevating glial cell derived neurotrophic factor in striatum［J］.Neuroscience，2010，167(1):174-184.

［2］Bi J，Wang XB，Chen L，Hao S，An LJ，Jiang B，et al.Catalpol protects mesencephalic neurons against MPTPinduced neurotoxicity via attenuation of mitochondrial dysfunction and MAO-B activity［J］.Toxicol In Vitro，2008，22(8):1883-1889.

［3］Bi J，Jiang B，Hao S，Zhang A，Dong Y，Jiang T，et al.Catalpol attenuates nitric oxide increase via ERK signaling pathways induced by rotenone in mesencephalic neurons［J］.Neurochem Int，2009，54(3-4):264-270.

［4］Jiang B，Liu JH，Bao YM，An LJ.Catalpol inhibits apoptosis in hydrogen peroxide-induced PC12 cells by preventing cytochrome c release and inactivating of caspase cascade［J］.Toxicon，2004，43(1):53-59.

［5］Zhang ZQ，Liu YM，Xue BQ，Wei L.Protective effects of catalpol against H2O2induced oxidative damage in astrocytes［J］.China J Chin Mater Med(中國(guó)中藥雜志)，2009，34(15):1955-1958.

［6］Wang Z，Liu Q，Zhang R，Liu S，Xia Z，Hu Y.Catalpol ameliorates beta amyloid-induced degeneration of cholinergic neurons by elevating brain-derived neurotrophic factors［J］.Neuroscience，2009，163(4):1363-1372.

［7］Zhang ZX， Roman GC， Hong Z， Wu CB，Qu QM，Huang JB，et al.Parkinson's disease in China:prevalence in Beijing，Xi'an，and Shanghai［J］.Lancet，2005，365(9459):595-597.

［8］Mandel SA，Amit T，Kalfon L，Reznichenko L，Youdim MB.Targeting multiple neurodegenerative diseases etiologies with multimodal-acting green tea catechins［J］.J Nutr，2008，138(8):1578S-1583S.

［9］Li X，Yang D，Li L，Peng C，Chen S，Le W.Proteasome inhibitor lactacystin disturbs the intracellular calcium homeostasis of dopamine neurons in ventral mesencephalic cultures［J］.Neurochem Int，2007，50(7-8):959-965.

［10］Li X，Du Y，F(xiàn)an X，Yang D，Luo G，Le W.c-Jun N-terminal kinase mediates lactacystin－induced dopamine neuron degeneration［J］.J Neuropathol Exp Neurol，2008，67(10):933-944.

［11］Xie W，Li X，Li C，Zhu W，Jankovic J，Le W.Proteasome inhibition modeling nigral neuron degeneration in Parkinson's disease［J］.J Neurochem，2010，115(1):188-199.

［12］Biedler JL，Roffler-Tarlov S，Schachner M，F(xiàn)reedman LS.Multiple neurotransmitter synthesis by human neuroblastoma cell lines and clones［J］.Cancer Res，1978，38(11 Pt 1):3751-3757.

［13］Zhu HF，Wan D，Zhang F.Progress in studies of pharmacological action and mechanisms of catalpol on brain disease［J］.China J Chin Mater Med(中國(guó)中藥雜志)，2009，34(23):2983-2986.

［14］Agid Y.Aging，disease and nerve cell death［J］.Bull Acad Natl Med，1995，179(6):1193-1203.

［15］Wang ZH，He JC，Zhang CY.Effect of compound rehmannia recipe on appotosis in Parkinson's disease rats［J］.J New Chin Med(新中醫(yī))，2010，42(14):86-88.

［16］McNaught KS，Olanow CW.Proteolytic stress:A unifying concept for the etiopathogenesis of parkinson's［J］.Ann Neurol，2003，53(3):S73-S86，

［17］Yew PR. Ubiquitin-mediated proteolysis of vertebrate G1-and S-phase regulators［J］.J Cell Physiol，2001，187(1):1-10.