霍仕霞，康雨彤，彭曉明，高 莉，唐曉琴，彭 英，閆 明

(1.新疆維吾爾醫(yī)藥研究所細胞分子實驗室，新疆維吾爾醫(yī)方劑學(xué)實驗室，新疆烏魯木齊 830049;2.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所分析室，新疆烏魯木齊 830004)

白癜風(fēng)的發(fā)生與酪氨酸酶活性、細胞黑素含量及黑素細胞增殖的關(guān)系非常密切。黑素細胞通過氧化酪氨酸合成表皮黑素，酪氨酸酶是黑素合成的關(guān)鍵酶。文獻報道，增強酪氨酸酶活性和加速黑素生成的藥物能夠有效治療白癜風(fēng)［1］。維藥治療白癜風(fēng)有較好的療效，但作用機制尚不明確。驅(qū)白巴布期片是由補骨脂(Psoralea corylifolia L.)、驅(qū)蟲斑鳩菊〔Vernonia anthelmintica(Linn.)Willd〕、高良姜(Alpinia officinarum Hance)、盒果藤(Opercalina turperthum L.)和白花丹(Plumbago zeylanica L.)組成的維吾爾藥復(fù)方制劑，具有通脈和理血的作用，用于治療白癜風(fēng)［2］。本課題組通過工藝改進，將其制備成驅(qū)白巴布期膠囊(qubaibabuqi capsule，QBC)。本研究從細胞水平探討該膠囊含藥血清體外對人黑素瘤細胞A375增殖和遷移、酪氨酸酶活性及黑素生成的影響，為臨床治療白癜風(fēng)提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物和細胞

SD大鼠，雄性，體質(zhì)量180～220 g，由新疆維吾爾自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心實驗動物中心提供，許可證號:SYXK(新)2003-0003。人黑素瘤細胞A375由上海中科院細胞庫提供。

1.2 藥物、主要試劑和儀器

QBC由補骨脂、驅(qū)蟲斑鳩菊、高良姜、盒果藤和白花丹以質(zhì)量比6∶6∶3∶3∶2配伍組成，70%乙醇回流提取3次，濃縮干燥后，提取物加淀粉混勻，制備成每粒重0.25 g的膠囊(每粒膠囊相當(dāng)于原料藥0.1565 g)，其中每粒含補骨脂素不低于0.8041 mg，異補骨脂素不低于0.6606 mg，高良姜素不低于0.3522 mg。DMEM干粉培養(yǎng)基，美國Gibco公司;胎牛血清，美國Hyclone公司;MTT，美國Amresco公司。YJ-875凈化工作臺，中國上海蘇達實驗儀器廠;XD-101倒置顯微鏡，中國江南光電儀器有限公司;MCO-18AIC型CO2培養(yǎng)箱，日本Sanyo公司;Bip-Rad550型酶標儀，美國伯樂公司;MM-3微量振蕩器，江蘇沈高康健生化器具廠;DK-80電熱恒溫水槽，上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠。

1.3 QBC大鼠含藥血清的制備

QBC 200粒，去除膠囊殼，取內(nèi)容物，研勻。以0.5%羧甲基纖維素鈉溶液制備灌胃用的藥液。將20只大鼠隨機分為4組，正常對照組和QBC 0.54，2.7 和5.4 g·kg－1組，禁食12 h 后，正常對照組大鼠ig給予等體積0.5%羧甲基纖維素鈉，QBC組大鼠分別ig給藥。每天2次，連續(xù)3 d，末次給藥后2～3 h后腹主動脈無菌取血，825×g分離血清，－20℃保存?zhèn)溆谩ＥR用前56℃滅活30 min，0.22μm微孔濾膜除菌［3－4］。

1.4 MTT法測定人黑素瘤A375細胞存活

選擇對數(shù)生長期細胞，用0.25%胰酶消化，收集并調(diào)整細胞密度為5×107L－1，接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100μl。待細胞貼壁后棄去培養(yǎng)基，分別加入最終濃度為5%，10%，20%和30%正常對照組血清或含藥血清的培養(yǎng)液100μl，繼續(xù)培養(yǎng)48 h［5］。培養(yǎng)結(jié)束前 4 h，每孔加入 20 μl MTT 5 mg·L－1，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h后棄去上清液，每孔加入DMSO 150μl，震蕩10 min左右，使結(jié)晶完全溶解，立即于酶標儀490 nm處測定吸光度(absorbance，A)值［6］。每個樣品設(shè)4個復(fù)孔。

1.5 人黑素瘤A375細胞酪氨酸酶活性［7］的測定

分別將各組含藥血清加入細胞上，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，棄去培養(yǎng)液，PBS液洗2次，每孔加體積分數(shù)為0.01的 TritonX-100溶液50μl;迅速置 －80℃凍存30 min;隨后室溫融化;37℃預(yù)溫后加入0.1%左旋多巴溶液10μl，置37℃電熱恒溫水槽中反應(yīng)2 h，于酶標儀490 nm處測定A值。每個樣品設(shè)4個復(fù)孔。

1.6 人黑素瘤A375細胞黑素含量［8］的測定

選擇對數(shù)生長期的細胞，用0.25%胰酶消化，收集并調(diào)整細胞密度為5×107L－1，接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100μl。待細胞貼壁后棄去培養(yǎng)基，分別加入終濃度為20%的正常對照組血清或含藥血清的培養(yǎng)液100μl，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，棄去培養(yǎng)液，用 PBS液洗 2次，每孔加入 100μl NaOH 1 mol·L－1，置 37℃ 48 h 后，于酶標儀 490 nm 處測定A值。每個樣品設(shè)4個復(fù)孔。

1.7 人黑素瘤A375細胞遷移能力的測定

1.7.1 Transwell微孔膜法

選擇對數(shù)生長期的細胞，用0.25%胰酶消化，收集并調(diào)整細胞密度為1×108L－1，接種于24孔板，每孔1 ml。待細胞貼壁后棄去培養(yǎng)基后，分別加入終濃度為20%的正常對照組血清或含藥血清的培養(yǎng)液1 ml，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，胰酶消化并用培養(yǎng)基稀釋為2×108L－1，取200μl加入用30μl人纖維粘連蛋白5 ml·L－1預(yù)處理過的Transwell小室的上室中繼續(xù)培養(yǎng)18 h，取出Transwell，用棉簽擦去上室細胞和人纖維粘連蛋白，用PBS洗3遍，將小室放入醋酸∶甲醇=1∶3(V/V)的固定液600μl中4℃固定30 min，晾干，姬姆薩染色10 min，PBS洗滌5遍，晾干后將小室放在載玻片上，置于顯微鏡下觀察細胞，于不同視野拍照，每組8張，進行細胞計數(shù)［9］。

1.7.2 劃痕實驗

選擇對數(shù)生長期的細胞，用0.25%胰酶消化，收集并調(diào)整細胞密度為1×1011L－1，接種于24孔板，每孔1 ml。培養(yǎng)24 h后，用200μl槍頭在孔底均勻劃出2道劃痕，棄去培養(yǎng)基，用PBS輕輕清洗3次，除去漂浮細胞。分別加入終濃度為20%的正常對照組血清或含藥血清的培養(yǎng)液1 ml。每組2個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)18 h，顯微鏡下觀察細胞遷移情況［10］。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 含QBC血清對人黑素瘤A375細胞增殖的影響

表1結(jié)果顯示，與正常對照組相比，QBC 0.54 g·kg－1組大鼠含藥血清濃度為 30% 時，對A375黑素瘤細胞具有促增殖作用(P＜0.05);QBC 2.7 g·kg－1大鼠含藥血清濃度為10%時具有促增殖作用(P ＜0.01);QBC 5.4 g·kg－1含藥血清濃度為20%時具有促增殖作用(P＜0.05)。

2.2 含QBC血清對人黑素瘤A375細胞酪氨酸酶活性的影響

表2結(jié)果顯示，與正常對照組相比，QBC 0.54 g·kg－1組含藥血清濃度為 5%時對 A375 人黑素瘤細胞具有促酪氨酸酶活性的作用(P＜0.05);QBC 2.7 g·kg－1組含藥血清濃度為5%和 10%時，有抑制酪氨酸酶活性作用(P＜0.01或P＜0.05);QBC 5.4 g·kg－1組含藥血清濃度為 5%，10% 和 20%時，有促酪氨酸酶活性作用(P＜0.05或P＜0.01)。

2.3 含QBC血清對人黑素瘤A375細胞黑素生成的影響

表3結(jié)果顯示，與正常對照組相比，QBC 2.7和5.4 g·kg－1含藥血清對 A375細胞具有顯著促黑素含量增加的作用(P ＜0.05，P ＜0.01);且 QBC 5.4 g·kg－1含藥血清促黑素含量增加的能力明顯高于 QBC 2.7 g·kg－1(P ＜0.01)。QBC 0.54 g·kg－1含藥血清無顯著增加黑素含量的作用。

Tab.1 Effect of Qubaibabuqi capsule(QBC)containing serum on human melanoma A375 cell proliferation

Tab.2 Effect of serum-containing QBC on tyrosinase activity of human melanoma A375 cells

Tab.3 Effect of QBC containing 20%serum on melanin content in human melanoma A375 cells

2.4 QBC含藥血清對人黑素瘤A375細胞遷移能力的影響

Transwell微孔膜法實驗結(jié)果(表4)顯示，與正常對照組相比，QBC 0.54，2.7 和 5.4 g·kg－1大鼠20%含藥血清均能顯著提高A375細胞的遷移能力(P ＜0.01)。QBC 5.4 g·kg－1含藥血清促 A375 細胞的遷移能力明顯高于2.7 g·kg－1，并且有隨劑量增加作用增強的趨勢。

劃痕結(jié)果表明(圖1)，與正常對照組的(104±6)μm相比，QBC 0.54，2.7 和 5.4 g·kg－1含藥血清組細胞劃痕邊界距離分別為50±3，43±5和(12±2)μm，說明均能明顯促進A375細胞傷痕愈合，而QBC 5.4 g·kg－1含藥血清促傷口愈合能力明顯強于 QBC 0.54和2.7 g·kg－1組(P ＜0.01)，提示 QBC 可能有促進A375細胞遷移的能力。

Tab.4 Effect of QBC containing 20%serum on migration of human melanoma A375 cells

Fig.1 Effect of QBC on migration of A375 cells.A:normal control;B，C and D:QBC 0.54，2.7 and 5.4 g·kg－1 group，respectively.

3 討論

血清藥理學(xué)是近年來建立和發(fā)展起來的一種適合于體外研究中藥藥理的新方法，主要是通過研究給藥動物血清的生物學(xué)活性來揭示藥物作用機制。本研究通過合并一組動物的血清消除個體差異。預(yù)實驗中，進行了含藥血清滅活與不滅活的比較及采用不同給藥劑量進行體外篩選，最后確定采用滅活后的含藥血清，增大給藥劑量以便優(yōu)選體外實驗所需合適的血清比例，確保了實驗結(jié)果的可靠性［11］。

近年來，針對中藥對酪氨酸酶活性影響進行了較大規(guī)模篩查，并在此基礎(chǔ)上以黑素瘤細胞和動物模型進行實驗。本研究結(jié)果顯示，QBC含藥血清顯著促進黑素的合成，且具有一定的劑量相關(guān)性，并能顯著促進細胞增殖。研究發(fā)現(xiàn)，白癜風(fēng)早期皮損處黑素細胞數(shù)量明顯減少，故細胞數(shù)量的增加在一定程度上有利于色斑恢復(fù)［12］。QBC含藥血清能夠上調(diào)酪氨酸酶活性，促使黑素細胞合成色素增加。

白癜風(fēng)晚期患者皮膚基底層黑素細胞完全消失，患者白斑區(qū)色素恢復(fù)只能依賴于毛囊外毛根鞘處黑素細胞儲庫或白斑區(qū)周邊黑素細胞的活化、增殖和遷移，且以毛囊為主。刺激毛囊前體及白斑區(qū)周邊區(qū)黑素細胞增殖和向病灶遷移亦是一條重要的治療思路。本研究在觀察了QBC對黑素合成影響的基礎(chǔ)上，進一步研究其對黑素細胞遷移的影響，有助于全面闡明其作用機制。

本研究表明，QBC不但能促進黑素合成，還能促使黑素細胞向病灶部位遷移，提示其可能通過不同的作用機制發(fā)揮治療作用，但對其中的具體有效活性成分尚待更深入的研究。

［1］Manga P，Sato K，Ye L，Beermann F，Lamoreux ML，Orlow SJ.Mutational analysis of the modulation of tyrosinase by tyrosinase-related proteins 1 and 2 in vitro［J］.Pigment Cell Res，2000，13(5):364-374.

［2］Ministry of Health of the People's Republic of China.Uygur Pharmaceutical Standards［S］.Xinjiang Science and Technology Publishing House，1999.

［3］Xu SY，Bian RL，Chen X.Methodology of Pharmacological Experiments(藥理實驗方法學(xué))［M］.Beijing:People's Medical Publishing House，2001:202-203.

［4］Cheng DQ，Wei XD，Wang SQ，Xu AE.Effect of traditional Chinese medical on the tyrosinase activity and melanogenesis in B-16 murine melanoma［J］.Chin J Dermatol(中國皮膚科雜志)，2000，33(3):173-174.

［5］Cha XS，Liu YI，LI Y.The effects of medicated blood serum with compound Chinese drugs on melanocytes proliferation and tyrosinase activity［J］.Chin J Dermol Venereol(中國皮膚性病學(xué)雜志)，2008，22(11):652-654.

［6］Zhang L，Zhao JX，Li P，Liu WH，Wang JS.In vitro study of drug contained serum with Chinese medicines nourish liver and kidney on B16M elanocyte cytotoxicity，melanin synthesis and cAMP［J］.Liaoning J Tradit Chin Med(遼寧中醫(yī)雜志)，2009，36(3):467-469.

［7］Wang H，Wang JS，Wang P，Cai NN，Tao Y，Guo NJ.Effects of traditional Chinese medicine for nourishing liver and kidney on melanogenesis in normal human melanocytes in vitro［J］.Chin J Dermatol Venereol Integ Trad Western Med(中國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)雜志)，2004，3(4):208-210.

［8］Deng RC，Zhou Y，Zhang JG，Xu JG，Shang J，Yu LH.Effect of Vernonia anthelmintica Willd.on tyrosinase activity andmelanogenesis in A375 human melanoma［J］.Lett Biotechnol(生物技術(shù)通訊)，2002，13(2):135-137.

［9］Zhang XQ，F(xiàn)eng J，Mou KH，Ma HQ，Niu XW，Liu C.Effects of bFGF andα-MSH on adhesion and migration of human melanocytes in vitro［J］.J Zhejiang Univ:Med Sci(浙江大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版)，2006，35(2):161-164.

［10］Zhang XQ，Mou KH，Ma HQ，Zhao J，Yan XN，F(xiàn)eng J.Effects ofα-MSH on melanocytemigration and intracellular［Ca2+］iin vitro［J］.J Med Postgrad(醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報)，2005，18(5):391-392，396.

［11］Cui L， Yan WD， Gao TW. Review and prospect of methods in serum pharmacology on Chinese herbal medicine［J］.Med J Chin PAPF(武警醫(yī)學(xué))，2004，15(6):460-461.

［12］Zhou MN， Lin FQ， Guan CP， Fu LF，Hong WS，Xu AE.Effect of InnVit gene on migration of immortally melanocyte B10BR［J］.Chin J Dermatol Venereol Integ Trad Western Med(中國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)雜志)，2010，9(2):75-78.