龔春紅

湖北省咸寧市中心醫(yī)院，湖北咸寧 437100

短串聯(lián)重復(fù)系列在胎兒性別鑒定中的應(yīng)用

龔春紅

湖北省咸寧市中心醫(yī)院，湖北咸寧 437100

目的 探索一種靈敏、可靠、安全的胎兒性別鑒定方法。 方法 采集20例妊娠8周以上夫婦的外周血漿，采用密度梯度離心法濃縮核酸片段，并以此為模板，以實(shí)時(shí)熒光PCR（polymerase chain reaction）技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增Y染色體DYS19，DYS389，DYS390，DYS393上特異的短串聯(lián)重復(fù)系列。 結(jié)果 20例孕婦標(biāo)本查出有DYS19產(chǎn)物 9例，DYS389產(chǎn)物12例，DYS390產(chǎn)物12例，DYS393產(chǎn)物10例，孕婦中擴(kuò)增到的短串聯(lián)重復(fù)系列在丈夫標(biāo)本內(nèi)都檢測(cè)到。根據(jù)PCR結(jié)果判斷13例男性胎兒，與隨訪結(jié)果完全相同。 結(jié)論 以孕婦及其丈夫外周血漿為標(biāo)本，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)擴(kuò)增Y染色體短串聯(lián)重復(fù)系列可用于早期胎兒性別鑒定。

短串聯(lián)重復(fù)系列；實(shí)時(shí)熒光PCR；性別鑒定

Y染色體大部分不與X染色體重組，這些非重組區(qū)只能由父親傳給兒子?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)了一些Y染色體特異短串聯(lián)重復(fù)序列（Y chromosome specific short tandem repeat，簡(jiǎn)稱 Y 染色體特異STR），為研究群體親緣關(guān)系提供了新型的遺傳標(biāo)記來源[1-2]。因此，檢測(cè)孕婦外周血中是否存在某些Y染色體特異重復(fù)系列就可能預(yù)測(cè)胎兒性別，這為胎兒伴性遺傳病的風(fēng)險(xiǎn)估計(jì)提供可能，為優(yōu)生優(yōu)育提高人口質(zhì)量有重要意義。筆者對(duì)20位孕婦及其丈夫外周血漿進(jìn)行Y染色特異短串聯(lián)重復(fù)系列的檢測(cè)，將預(yù)判結(jié)果與產(chǎn)后隨訪結(jié)果比較，旨在探索一種簡(jiǎn)便可靠的早期胎兒性別鑒定方法。

1 材料與方法

1.1 模板DNA片段提取

從20名孕婦及其丈夫抽取外周血5 mL，EDTA-K2抗凝，4℃低溫離心分離血漿，以蔗糖為介質(zhì)進(jìn)行密度梯度離心，然后純化DNA并配成一定濃度范圍。

1.2 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)Y染色體特異短串聯(lián)重復(fù)系列

擴(kuò)增的特異短串聯(lián)重復(fù)系列見表1，引物及探針由美國(guó)Promega公司生產(chǎn)提供?？偡磻?yīng)體積為25 μL，含有1×PCR緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L KCl），100 μmol/L dNTP，1.5 mmol/L MgCl2，0.4 μmol/L 引物，和 5U TaqDNA 聚合酶，每個(gè)反應(yīng)里有提取DNA 5 μL，在Gene Amp 9700進(jìn)行熱循環(huán)，條件如下：起始變性溫度T為 90℃10 min，接下來進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，90℃ 30 s，58℃ 15 min，和 72℃ 15 s，最終 60℃延伸1 min。每個(gè)血漿樣本進(jìn)行測(cè)試2次，雙蒸水作為空白對(duì)照。

表1 Y染色體特異STR基因座核心序列結(jié)構(gòu)

2 結(jié)果

20例孕婦標(biāo)本查出有DYS19產(chǎn)物9例，DYS389產(chǎn)物12例，DYS390產(chǎn)物12例，DYS393產(chǎn)物10例，孕婦中擴(kuò)增到的短串聯(lián)重復(fù)系列在丈夫標(biāo)本內(nèi)都檢測(cè)到。根據(jù)檢測(cè)到其中一種系列者為男性標(biāo)準(zhǔn)，20例孕婦有13例懷男性胎兒，其結(jié)果與產(chǎn)后隨訪完全一致。見表2。

3 討論

目前有200多種伴性遺傳病，杜絕或減少遺傳病患兒的出生是關(guān)系到家庭幸福與社會(huì)人口質(zhì)量的重要問題。對(duì)胎兒進(jìn)行早期性別鑒定，對(duì)有患病風(fēng)險(xiǎn)者進(jìn)行人工終止妊娠是減少此類患兒發(fā)生重要手段。目前關(guān)于胎兒性別鑒定的方法有多種。它們存在各種各樣的缺陷，有的要求妊娠時(shí)間過長(zhǎng)，實(shí)行終止妊娠手術(shù)給孕婦帶來身體上和精神上負(fù)擔(dān)過大；有的標(biāo)本取材較難有一定的風(fēng)險(xiǎn)，或?qū)嶒?yàn)時(shí)間過長(zhǎng)不方便患者；有的準(zhǔn)確度尚不能達(dá)到臨床要求。筆者以孕婦和其丈夫外周血漿為標(biāo)本，采用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)進(jìn)行Y染色體特異重復(fù)序列分析，基本克服了以上諸多缺點(diǎn)。

表2 實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及胎兒性別情況

現(xiàn)已有研究發(fā)現(xiàn)，母-胎之間存在微量血液交換，母親體內(nèi)存在極少的胎兒紅細(xì)胞和核酸片段，胎兒來源的核酸片段較母親自身的片段短[3-4]。所以，通過密度梯離心技術(shù)可以濃集核酸的同時(shí)也可以區(qū)分不同來源的核酸，可以得到更純的胎兒DNA模板。實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)操作簡(jiǎn)便，封閉操作污染少，背景干擾小，結(jié)果判斷客觀。Y染色體短串聯(lián)重復(fù)系列只能由父?jìng)鹘o兒子，所以本方法特異性好，同時(shí)串聯(lián)重復(fù)系列備份多，所以較其他系列更易得到擴(kuò)增產(chǎn)物，加之測(cè)定多個(gè)短串聯(lián)重復(fù)序列，使得方法靈敏度較高。以父親血漿標(biāo)本擴(kuò)增結(jié)果作為對(duì)照，防止親代不存在所選特異短串聯(lián)重復(fù)系列所致假陰性的可能。本研究結(jié)果顯示，懷男性胎兒孕婦查出Y染色體短串聯(lián)重系列數(shù)平均為3.31±0.63，4種或任何3種組合短串聯(lián)重復(fù)系列至少檢出其中一種的概率為100%（13/13），即準(zhǔn)確度為100%。這說明孕婦外周血中確實(shí)存在胎兒核酸片斷，以此模板擴(kuò)增性別決定基因進(jìn)行胎兒性別鑒定是完全可行。但不同個(gè)體檢出的系列有微小差別，這可能是因?yàn)槎檀?lián)系列在群體間存在突變[5]，此突變對(duì)性別判斷的影響可被多重PCR檢測(cè)多個(gè)短串聯(lián)重復(fù)系列所克服。所以，以孕婦外周血血漿為材料，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測(cè)Y染色體短串聯(lián)重復(fù)系列應(yīng)用于胎兒早期性別鑒定的方法值得探索參考。

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Application of short tandem repeats to identify the sex of fetal

GONG Chunhong
The Central Hospital of Xianning City,Hubei Province,Xianning 437100,China

Objective To explore a safe sensitive and practicable method to identify fetal sex.Methods The DNA fragment of Y chromosome from plasma of 20 pregnant women and their husband were collected by density gradient centrifuge,which served as template to amplify the short tandem repeats(STRs)on gene DYS19,DYS389,DYS390,DYX391.Results From the 20 women cases,the authors got its products of DYS19,DYS389,DYS390 and DYS391 individual 9 cases,12 cases,12 cases,10 cases,10 cases.The same products could be got in the plasma from the correspondent husbands.According to the products,13 children were diagnosed as boys before birth,which was accord to the follow-up.Conclusion Y-specific STRs are good markers for identification of fetal sex at early stage.Peripheral blood plasma is reliable and ideal material.

Short tandem repeats;Real time fluorescent polymerase chain reaction;Sex identification

R714.52

A

1673-7210（2012）03（b）-0092-02

龔春紅（1975.3-），女，本科，主管技師；研究方向：臨床檢驗(yàn)。

2011-09-16 本文編輯：郝明明）