常愛(ài)敏，馬彥清，馬進(jìn)，劉春霞，陳云昭，蔣金芳，李鋒

（1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理系／新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子832002；2伊犁州友誼醫(yī)院胸心外科，伊犁835000）

食管癌（Esophageal Carcinoma，EC）是人類(lèi)常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，以鱗癌最為常見(jiàn)［1］，新疆北部以游牧為生的哈薩克族聚集區(qū)是我國(guó)食管癌集中高發(fā)區(qū)之一［2］。

P63基因是抑癌基因P53家族成員之一，兩者在結(jié)構(gòu)和功能上均有高度同源性。P63基因某些蛋白異構(gòu)體能夠反式激活P53靶基因的轉(zhuǎn)錄并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，被認(rèn)為是腫瘤抑制基因，另一些異構(gòu)體則被認(rèn)為是致癌基因［3］。P63蛋白是腫瘤和細(xì)胞凋亡研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)之一。

目前，P63在該地區(qū)食管癌癌變過(guò)程中的變化特征和作用機(jī)制尚不清楚，因此，本研究在課題組前期工作的基礎(chǔ)上，應(yīng)用組織芯片和免疫組化技術(shù)研究P63蛋白在哈族食管鱗癌及癌旁非癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系，為進(jìn)一步闡明P63基因在食管癌發(fā)生發(fā)展中的作用提供證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1材料收集1996～2011年石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院、新疆伊犁州友誼醫(yī)院、新疆伊犁州新華醫(yī)院、新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)農(nóng)四師醫(yī)院和新疆奎屯伊犁州人民醫(yī)院病理科哈薩克族食管鱗癌石蠟包埋組織標(biāo)本85例。其中男性56例，女性29例，患病平均年齡59.4歲（34～78歲）。按食管癌國(guó)際TNM標(biāo)準(zhǔn)分期（2010年）。所有患者術(shù)前均未接受放化療及其他抗腫瘤治療。37例正常食管組織均來(lái)自上述腫瘤患者的癌旁非癌組織。

1.1.2主要試劑鼠抗人P63單克隆抗體（工作液1∶200）、Envision二步法試劑盒（北京中杉金橋公司）；枸櫞酸緩沖液、DAB顯色試劑盒 （Dako公司）。

1.2 方法

組織芯片的免疫組化染色采用Envision法，具體操作參照抗體說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，主要步驟如下：組織標(biāo)本經(jīng)過(guò)常規(guī)石蠟包埋，脫蠟水化后，于枸櫞酸緩沖液（0.01 mol／L，p H 6.0）中微波加熱進(jìn)行抗原修復(fù)10 min。其余步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作（抗體稀釋濃度為1∶200）。PBS代替一抗作陰性對(duì)照，由試劑公司提供的照片作陽(yáng)性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定

采用免疫組化Envision法檢測(cè)P63蛋白表達(dá)情況，嚴(yán)格按照免疫組化步驟進(jìn)行操作，P63染色結(jié)果主要定位于細(xì)胞核，結(jié)果判定由兩位病理學(xué)專(zhuān)家閱片，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分比，兩位閱片專(zhuān)家意見(jiàn)不一致時(shí)請(qǐng)第三方閱片，最終決定免疫組化結(jié)果。

表1 免疫組化結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 The results of immunohistochemistry criteria

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，四格表χ2檢驗(yàn)及行×列表χ2檢驗(yàn)，P＜0.05（雙側(cè)）有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 P63蛋白在食管鱗癌和癌旁非癌組織芯片中表達(dá)

檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1～4。

圖1 P63在食管鱗癌組織中細(xì)胞核表達(dá) ＋（×100）Fig.1 Nuclear expression of P63＋in esophagea squamous cell carcinoma（×100）

圖2 P63在食管鱗癌組織中細(xì)胞核表達(dá) ＋＋（×100）Fig.2 Nuclear expression of P63＋ ＋in esophagea squamous cell carcinoma（×100）

圖3 P63在食管鱗癌組織中細(xì)胞核表達(dá) ＋＋＋（×100）Fig.3 Nuclear expression of P63＋＋＋in esophagea squamous cell carcinoma（×100）

圖4 P63在癌旁非癌組織中細(xì)胞核表達(dá) ＋（×100）Fig.4 Nuclear expression of P63＋in non－cancerous adjacent tissue（×100）

由85例新疆哈薩克族食管鱗癌構(gòu)成的組織芯片中，P63蛋白在71例（83.5%）食管鱗癌中表達(dá)陽(yáng)性，其中54例（63.5%）強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)（＋＋／＋＋＋）（圖1，圖2，圖3）。37癌旁非癌組織中，22例表達(dá)陽(yáng)性（圖4），表達(dá)陽(yáng)性率為59.4%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)卡方檢驗(yàn)分析，結(jié)果表明P63在食管鱗癌及癌旁非癌組織中蛋白表達(dá)差異有顯著性（χ2＝8.242，P＜0.005），且P63在哈族食管鱗癌組織中表達(dá)高于癌旁非癌組織中的表達(dá)（表2）。

表2 P63蛋白在新疆哈薩克族食管鱗癌及癌旁非癌組織中的表達(dá)情況Tab.2 The expression of p63 protein in esophageal squamous cell carcinoma and adjacent non－cancerous tissue in the expression of Kazak

2.2 P63表達(dá)與食管鱗癌臨床病理特征的關(guān)系

食管鱗癌中P63表達(dá)陽(yáng)性率與年齡、性別、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果如表3所示。

由表3可知：P63表達(dá)陽(yáng)性率與年齡、性別、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期均無(wú)明顯相關(guān)性（P＞0.05）。

P63表達(dá)陽(yáng)性率與新疆哈薩克族食管鱗癌分化程度有關(guān)，（χ2＝14.286，P＜0.05）。

表3 P63蛋白表達(dá)與新疆哈薩克族食管鱗癌臨床病理特征的關(guān)系Tab.3 The relationship of p63 protein and clinicopathological characteristics of esophageal squamous cell carcinoma in Xinjiang Kazakh

3 討論

P63基因是1998年Yang等［4］在人類(lèi)及大鼠基因組中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)與P53同源的基因家族新成員，定位于3q27－3q29，在結(jié)構(gòu)與功能上都與P53有高度的同源性，被認(rèn)為是P53家族的新成員。P53的主要功能是誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和凋亡，具有抗腫瘤作用［5］，而P63對(duì)于上皮干細(xì)胞的增殖、生存和上皮組織的形態(tài)發(fā)生等具有重要的意義［6］。研究表明［7］，P63基因高表達(dá)于許多上皮組織的基底層與生發(fā)層，且與鱗癌的發(fā)生關(guān)系密切。

最近一項(xiàng)研究表明［8］，食管癌中 miR－203基因可能通過(guò)抑制靶基因△Np63介導(dǎo)的信號(hào)通路抑制食管癌細(xì)胞增殖。在成人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞增殖、分化過(guò)程中，miR－203下游直接靶基因?yàn)椤鱊p63，且在人類(lèi)頭頸部及肺部鱗狀細(xì)胞癌中研究發(fā)現(xiàn)miR－203同樣可以調(diào)控△Np63 m RNA和蛋白表達(dá)水平［9－10］，這些結(jié)果提示 P63的過(guò)度表達(dá)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，但具體的分子機(jī)制還不清楚，需要進(jìn)一步深入的研究。

本研究首次利用組織芯片技術(shù)高通量的研究P63蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，新疆哈族食管鱗癌組織中的P63蛋白呈高表達(dá)，表達(dá)陽(yáng)性率為83.5%，癌旁非癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為59.4%，兩者陽(yáng)性表達(dá)率統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異（P＜0.01），本實(shí)驗(yàn)中由于癌旁非癌組織的樣本量較?。?5例）在后續(xù)試驗(yàn)中講一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行研究。在食管鱗癌組織中P63表達(dá)明顯高于癌旁非癌組織中的表達(dá)，且與腫瘤的分化程度有關(guān)，提示P63參與了新疆哈薩克族食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展，然而，P63的高表達(dá)的是腫瘤發(fā)生的原因還是結(jié)果，尚需更進(jìn)一步的研究。

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