張定國，黃先忠，東銳，鄭銀英，崔百明

（石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院／農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子832003）

FT（Flowering Locus T）基因是光周期途徑中決定植物開花的重要因子。CO和FT基因在植物開花中起著關(guān)鍵作用，CO基因在長日照下能夠誘導(dǎo)葉片F(xiàn)T基因的表達(dá)，當(dāng)FT基因在莖尖特異表達(dá)時(shí)可以促進(jìn)花芽分化。FT蛋白（誘導(dǎo)開花的成花素信號(hào)分子）從葉片經(jīng)過韌皮部長距離運(yùn)輸?shù)竭_(dá)莖頂端分生組織后，與頂端組織特異表達(dá)的Flowering Locus D（FD）基因編碼產(chǎn)物之間結(jié)合，形成一種蛋白復(fù)合體，共同促進(jìn)下游成花基因Apetala 1（AP1）、Leafy（LFY）等的表達(dá)，從而促進(jìn)植物開花［1］。棉花Gh FTL1基因已經(jīng)被克隆，系統(tǒng)進(jìn)化分析表明Gh FTL1屬于FT亞家族成員［2］。

染色體步移技術(shù)（Genome walking）是一種重要的分子生物學(xué)研究技術(shù)，使用這種技術(shù)可以有效獲取與已知序列相鄰的未知序列。熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR（Thermal asymmetric interlaced PCR，TAILPCR）技術(shù)［3］因快速、簡單、高效等優(yōu)點(diǎn)而備受青睞，目前已有大量成功報(bào)道［4］。Wang 等［5］利用 TAIL－PCR法分離了小球藻硝酸還原酶基因5′端側(cè)翼序列，將其與GUS基因融合并表達(dá)，結(jié)果顯示該側(cè)翼序列能啟動(dòng)GUS基因的表達(dá)，該片段含有硝酸還原酶基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)所必要的啟動(dòng)子元件。財(cái)音青格樂等［6］通過此方法，成功地克隆了大豆種子特異性啟動(dòng)子序 列 （約 700 bp）。李 秋 莉 等［7］也 應(yīng)用TAIL－PCR法成功地克隆了遼寧堿蓬BADH基因的啟動(dòng)子片段。Liu等［8］報(bào)道，TAIL－PCR 方法通?？梢詳U(kuò)增到0.2～2.0 kb的片段。因此，TAILPCR法是克隆未知啟動(dòng)子的一種有效、簡便的方法。

本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)獲得GhFTL1基因的序列［2］，為了研究Gh FTL1基因自身啟動(dòng)子的功能，利用TAIL－PCR方法從棉花基因組中分離了長度為715 bp的該基因序列片段，并對(duì)已得到的序列片段序列進(jìn)行分析，旨在為進(jìn)一步研究該啟動(dòng)子的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1植物材料

實(shí)驗(yàn)材料為新疆陸地棉品種新陸早33。

1.1.2菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌DH5α、根癌農(nóng)桿菌GV3101、植物表達(dá)載體pCAMBIA1301、p35S：：Gh FTL1為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取

棉花DNA提取采用CTAB法。

1.2.2引物的設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)已知棉花FT同源（登錄號(hào)HM631972）基因的序列，設(shè)計(jì)引物（華大基因合成）（表1）用作PCR擴(kuò)增。

表1 TAIL－PCR引物Tab.1 Primers of TAIL－PCR

1.2.3 pGhFTL1啟動(dòng)子片段的克隆

TAIL－PCR第1輪擴(kuò)增：以棉花葉片DNA為模板，在50μL的反應(yīng)體系中加入DNA模板2μL，5μL 10×LA Buffer，8μL d NTP Mixture，0.5μL 5U LA Taq DNA聚合酶，以AD1為正向引物，SP1為反向引物各1μL，dd H2O補(bǔ)齊。第2輪擴(kuò)增：將第1輪PCR反應(yīng)液稀釋100倍后，取1μL作為第2輪PCR反應(yīng)的模板，5μL 10×LA Buffer，8μL d NTP Mixture，0.5μL 5 U LA Taq DNA聚合酶，以AD1為正向引物，SP2為反向引物各1μL，dd H2O補(bǔ)齊。第3輪擴(kuò)增：將第2輪PCR反應(yīng)液稀釋100倍后，取1μL作為第3輪PCR反應(yīng)的模板，反應(yīng)體系與第2輪的相同。取上述各步PCR反應(yīng)液在1%的瓊脂糖凝膠上檢測(cè)，割下目的條帶，利用凝膠回收試劑盒純化后，將回收產(chǎn)物與載體p GEM－T Easy連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在涂有IPTG／X－gal及氨芐抗生素的LB平板上通過藍(lán)白斑篩選，挑取陽性克隆于LB培養(yǎng)基中過夜搖菌，小量提取質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定后，將陽性克隆交由北京華大基因公司測(cè)序。

第1輪反應(yīng)程序：94℃1 min，98℃1 min 1個(gè)循環(huán)；94℃30 s，61℃1 min，72℃2 min 5個(gè)循環(huán)；94℃30 s，25℃3 min，72℃2 min 1個(gè)循環(huán)；94℃30 s，61℃1 min，72℃2 min 94℃30 s，61℃1 min，72℃2 min 94℃30 s，44℃1 min，72℃2 min 15個(gè)循環(huán)；72℃10 min 1個(gè)循環(huán)。

第2輪反應(yīng)程序：94℃30 s，61℃1 min，72℃2 min 94℃30 s，61℃1 min，72℃2 min 94℃30 s，44℃1 min，72℃2 min 15個(gè)循環(huán)；72℃10 min 1個(gè)循環(huán)。

第3輪反應(yīng)程序：同第2輪反應(yīng)程序。

1.2.4 GhFTL1啟動(dòng)子的驗(yàn)證

為了驗(yàn)證所克隆的片段是GhFTL1的啟動(dòng)子，從已克隆的啟動(dòng)子片段中設(shè)計(jì)2個(gè)引物P－Jian－F－1：5′－TGGGGTGTGTATGCAGTTGT－3′，P－Jian－F－2，5′－GAATCACAGAAAG GGCAAGC－3′分 別和TAIL－PCR中所用到的SP1引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，以棉花葉片DNA為模板，在10μL反應(yīng)體系中加入DNA模板0.5μL，1μL 10×Hotmaster Buffer，1μL d NTP Mixture，0.1μL 2.5 U Hotmaster Taq DNA 聚合酶，以 P－Jian－F－1和 P－Jian－F－2為正向引物，SP1為反向引物各0.5μL，dd H2O補(bǔ)齊。

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃30 s，61℃1 min，72℃2 min 94℃30 s，61℃1 min，72℃2 min 94℃30 s，44℃1 min，72℃2 min 15個(gè)循環(huán)；72℃10 min 1個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 GhFTL1啟動(dòng)子片段的克隆與測(cè)序

利用引物 AD1、AD2、AD3和SP1、SP2、SP3分別進(jìn)行3組3輪PCR，第3輪擴(kuò)增出約為800 bp的產(chǎn)物（圖1），將第3輪PCR產(chǎn)物回收純化后連接到p GEM－T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取單克隆提取質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ酶切鑒定（圖2）。挑選其中陽性克隆進(jìn)行測(cè)序，將800 bp的測(cè)序結(jié)果經(jīng)DNAstar軟件分析，和已知的FT序列比對(duì)，該序列確實(shí)為Gh FTL1上游啟動(dòng)子序列。

圖1 Genome Walking PCR方法經(jīng)過三輪擴(kuò)增后PCR片段Fig.1 PCR fragments amplified by using genome Walking PCR

圖2 pGEM－T載體上的質(zhì)粒酶切鑒定Fig.2 The restriction enzyme digestion analysis of pGEM－T vector

2.2 GhFTL1啟動(dòng)子的驗(yàn)證

從已克隆的啟動(dòng)子片段中設(shè)計(jì)2個(gè)引物，分別與TAIL－PCR中所用到的SP1引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證。將PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。電泳結(jié)果（圖3）與預(yù)期結(jié)果一致。

圖3 PCR驗(yàn)證啟動(dòng)子Fig.3 PCR validation promoter

2.3 GhFTL1啟動(dòng)子序列分析

通過TAIL－PCR，獲得715 bp的啟動(dòng)子片段，經(jīng)Program NSITE（Softberry Inc.）序列分析表明，在該片段起始密碼子104 bp處有1個(gè)典型的TATA box，預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)在起始密碼子前69 bp處，除了有TATA box、CAAT box等基本元件外，還含有與光調(diào)節(jié)有關(guān)的元件，GT－1和SP1，另外還有如 CAr G box、GT－1＃Box7、telo－box、GS1b AC box 1等其他一些元件（圖4）以及逆境脅迫相關(guān)等的順式作用元件，通過同源克隆法先后從小擬南芥中克隆了一些耐逆基因，這些基因的啟動(dòng)子中有許多逆境脅迫元件［9－11］。

植物開花受環(huán)境因素和發(fā)育狀態(tài)的控制，在擬南芥中幾種開花信號(hào)，包括光周期應(yīng)答，集中在FT基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)水平上。當(dāng)擬南芥FT在長日照條件的誘導(dǎo)下FT在葉片的維管組織中轉(zhuǎn)錄，幾種轉(zhuǎn)錄抑制子參與了FT的調(diào)節(jié)，盡管這些元件對(duì)FT調(diào)節(jié)的重要性沒有完全得到證明，但FLC的MADS box與SVP形成的復(fù)合物與FT啟動(dòng)子近端區(qū)域和包含有CAr G boxe的第1個(gè)內(nèi)含子有一定的聯(lián)系［12］。FT的表達(dá)受FLC表達(dá)的抑制，這種抑制受FT啟動(dòng)子的介導(dǎo)，在FT的啟動(dòng)子中有1個(gè)CArG box。擬南芥FT基因編碼的蛋白產(chǎn)物是可以長距離轉(zhuǎn)運(yùn)的成花激素，可從葉片運(yùn)輸?shù)窖宽敹耍瑑?yōu)先在芽頂端表達(dá)的FD，對(duì)FT促進(jìn)開花是必需的，F(xiàn)D和FT通過蛋白互作，激活花分生組織特異性基因AP1，從而促進(jìn)開花［13］。

GT元件是一個(gè)光應(yīng)答元件。GT元件最初是在豌豆葉片rbcS－3A基因啟動(dòng)子中被鑒定出來，其核心序列為5′－GTGTGGTTAATATG。GT－1是一種蛋白，其可與光調(diào)節(jié)基因的啟動(dòng)子相互作用，分布在cab－E啟動(dòng)在的7個(gè)不同為點(diǎn)上。在cab－E基因的啟動(dòng)子內(nèi)GT－motifs是通過GT－1把他們結(jié)合在一起，rbcS－3A基因啟動(dòng)子與GT－1的結(jié)合位點(diǎn)序列和cab－E基因的啟動(dòng)子與GT－1的結(jié)合位點(diǎn)序列一致［14］。紫外光能能增強(qiáng)Tdc啟動(dòng)子的表達(dá)，通過紫外光證明了GT－1在Tdc中調(diào)節(jié)的功能。PsGS1b在整個(gè)植物的維管組織中表達(dá)，在不同的新陳代中銨鹽的重新利用中起重要作用，還可在酵母、擬南芥和松樹的細(xì)胞中激活轉(zhuǎn)錄［15］。分析了PsGS1b的啟動(dòng)子的403 bp的序列在該啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的1個(gè)區(qū)域含有大量的AC元件，這個(gè)區(qū)域被稱為GS1b AC box 1，其包含3種AC元件，AC元件能調(diào)節(jié)基因的表達(dá)［16］。siteⅡ和telobox是一種順式調(diào)節(jié)元件，與基因的分生表達(dá)有關(guān)。細(xì)胞循環(huán)的眾多基因啟動(dòng)子中siteⅡ和telo－box之間存在保守關(guān)聯(lián)，包括幾種細(xì)胞循環(huán)有關(guān)的基因和編碼核糖體蛋白的擬南芥153基因。植物在擬南芥啟動(dòng)siteⅡ元件的控制下可觀測(cè)到GUS基因的分生表達(dá)，而啟動(dòng)子中的telo－box能增強(qiáng)這一表達(dá)。telo－box在擬南芥中編碼延長因子基因的啟動(dòng)子中首次被觀測(cè)到，后來在幾種植物的RP啟動(dòng)子中也發(fā)現(xiàn)了這一元件［17］，已經(jīng)確定telo－box可激活細(xì)胞循環(huán)中一組基因的誘導(dǎo)表達(dá)或過量表達(dá)［18］。telobox不能完全依賴自身來激活基因的表達(dá)，但要同其他順式激活序列協(xié)同作用才能發(fā)揮作用。因此，初步推斷此序列片段可能是Gh FTL1基因的啟動(dòng)子。

圖4 pGhFTL1啟動(dòng)子的序列分析Fig.4 Sequence analysis of Cotton pGhFTL1 gene promoter

3 結(jié)論與討論

在轉(zhuǎn)基因棉工程中，有關(guān)啟動(dòng)子在棉花中的研究較多，但是大多數(shù)采用組成型啟動(dòng)子。其中所應(yīng)用的表達(dá)載體基本上是利用外源型啟動(dòng)子Ca MV 35S。Tail－PCR、SiteFinding－PCR 等克隆技術(shù)的發(fā)展，加快了啟動(dòng)子克隆的進(jìn)程。近年來，世界各國正在加快棉花基因組的測(cè)序，并且隨著克隆方法的不斷改進(jìn)，棉花基因組中各種類型的啟動(dòng)子已被大量克隆測(cè)序，其功能也在一定程度上得到驗(yàn)證。在棉花基因工程研究中，除利用外源啟動(dòng)子外，越來越多的棉花內(nèi)源啟動(dòng)子被開發(fā)出來，利用棉花內(nèi)源啟動(dòng)子本身的特性來改良基因在棉花中的表達(dá)。

TAIL－PCR技術(shù)［13］因快速、簡單、高效等優(yōu)點(diǎn)而備受青睞，本實(shí)驗(yàn)采用TAIL－PCR方法克隆了Gh FTL1啟動(dòng)子片段。特異性引物設(shè)計(jì)基本遵循一般PCR 引物設(shè)計(jì)原則［18］，為了提高 TAIL－PCR擴(kuò)增的特異性，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了兩處重要改進(jìn)：1）3條特異引物退火溫度均高于60℃，低于72℃，且3條特異引物sp1、sp2、sp3退火溫度依次升高，使第1輪及第2輪TAIL－PCR中的非特異擴(kuò)增片段不能進(jìn)一步有效擴(kuò)增，進(jìn)而提高終產(chǎn)物擴(kuò)增的特異性；2）特異性引物3′末端5～10個(gè)堿基中適當(dāng)提高G、C含量，尤其是3′末端5個(gè)堿基設(shè)計(jì)時(shí)不要出現(xiàn)二聯(lián)體或三連體的A或T，同時(shí)增加G或C堿基的個(gè)數(shù)，這樣可大幅減少特異引物的自身非特異擴(kuò)增。本實(shí)驗(yàn)采用改良的TAIL－PCR法取代5′RACE方法分離基因的5′端序列，為全長基因克隆提供了一種新選擇。改良后的TAIL－PCR技術(shù)很大程度地彌補(bǔ)了原TAIL－PCR技術(shù)非特異擴(kuò)增高、成功率低的缺陷，通過隨機(jī)引物的篩選及特異引物設(shè)計(jì)的改進(jìn)，極大地提高了TAIL超級(jí)循環(huán)中特異擴(kuò)增的效率，操作簡單，3輪超級(jí)循環(huán)在1 d內(nèi)就可完成，因此該技術(shù)省時(shí)省力、快速高效。改良后的TAIL－PCR技術(shù)對(duì)試劑、儀器等的要求相對(duì)較低，一般實(shí)驗(yàn)室均可滿足要求，因此該技術(shù)是進(jìn)行全長基因克隆的理想選擇，具有較廣闊的應(yīng)用前景。

對(duì)克隆的啟動(dòng)子片段進(jìn)行序列分析，在此啟動(dòng)子上不僅含有TATA box和CAAT box基本元件，而且含有與光調(diào)節(jié)有關(guān)的元件，如GT－1和SP1，另還外存在一些其他元件，在該片段在起始密碼子104 bp處有1個(gè)典型的TATA box，預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)在起始密碼子前69 bp處。

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