地力下·司馬義，李峰，張文杰

（石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理系／新疆地方病與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子832002）

結(jié)直腸癌是一種常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，局惡性腫瘤發(fā)病率第三位［1］。結(jié)直腸癌發(fā)病率較高的地區(qū)為歐美發(fā)達(dá)國(guó)家，澳大利亞男性和女性發(fā)病率分別為48.2／萬(wàn)和36.9／10萬(wàn)［2］，北美發(fā)病率為44／10萬(wàn)，隨著我國(guó)工業(yè)化程度的增加，我國(guó)的結(jié)直腸癌發(fā)病率出現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，男性發(fā)病率為15／10萬(wàn)，女性發(fā)病率為9.7／10萬(wàn)；病死率為8.6／10萬(wàn)和5.4／10萬(wàn)［3］。結(jié)直腸癌的發(fā)病危險(xiǎn)因素主要包括：飲食和生活方式——高脂肪、高熱量和缺乏運(yùn)動(dòng)；腸道的慢性炎癥，目前已經(jīng)證實(shí)腸道的長(zhǎng)期慢性炎癥可以進(jìn)展為癌［4］；Crohn?。环晴摅w類(lèi)抗炎藥的過(guò)量使用及遺傳背景。結(jié)直腸癌的治療主要是手術(shù)切除輔以放療和化療，手術(shù)切除腸內(nèi)息肉可以有效的預(yù)防結(jié)直腸癌的發(fā)病。近年的研究發(fā)現(xiàn)IL－17在多種自身免疫性疾病及腫瘤中發(fā)揮重要作用，對(duì)IL－17的研究可以為結(jié)直腸癌的分子靶向治療提供新的思路。

IL－17的發(fā)現(xiàn)已有二十年，IL－17作為一種促炎癥因子發(fā)現(xiàn)參與多種自身免疫性疾病以及某些腫瘤的發(fā)病過(guò)程。在IL－17敲除的小鼠黑色素瘤及膀胱癌模型中腫瘤的生長(zhǎng)速度明顯低于野生型小鼠［5］。TH 細(xì) 胞 在IL－6，IL－23，TGF－β 的 作 用 下 分 化 為T(mén)H17細(xì)胞，分泌IL－17，通過(guò)激活I(lǐng)L－17下游靶基因及信號(hào)通路，可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)并且擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，最終促進(jìn)上皮細(xì)胞內(nèi)瘤變而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。同時(shí)TH17細(xì)胞分泌的IL－17具有促血管生成作用，與以上作用一起促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。腫瘤組織通過(guò)釋放前列腺素2（PGE2）可以增加TH17細(xì)胞的分化，使整個(gè)過(guò)程不斷放大。但是IL－2，IL－4，IL－10，IFN－γ又可以抑制 TH17細(xì)胞的分化，從而對(duì)抗IL－17的促腫瘤作用［6－8］。由此得出，對(duì)IL－17的研究可以為腫瘤特異性分子靶向治療提供一個(gè)新思路，提示阻斷IL－17可以抑制腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展。

1 材料與方法

1.1 材料

收集我院2004年1月1日至2008年12月31日手術(shù)切除的結(jié)直腸癌組織石蠟標(biāo)本95例，年齡范圍33歲至85歲，年齡中位數(shù)66歲。其中結(jié)腸癌43例，直腸癌42例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移37例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移58例。按照2000年版世界衛(wèi)生組織消化系統(tǒng)腫瘤分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)癌組織進(jìn)行組織學(xué)分型。其中中分化腺癌79例，低分化腺癌15例，未分化癌1例。并且取癌旁組織（切緣距離癌灶邊緣5cm以外的組織）90例作為對(duì)照組。所有患者術(shù)前均未接受放療、化療及免疫治療。

1.2 方法

采用免疫組織化學(xué)S－P法。組織標(biāo)本經(jīng)過(guò)10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，5μm連續(xù)切片。脫蠟水化后，用p H6.0枸櫞酸鹽緩沖液中高壓熱修復(fù)。首先將枸櫞酸鹽修復(fù)液在高壓鍋中煮沸，再放入切片，蓋上鍋蓋，高火燒至冒氣，再調(diào)至低火，電磁爐功率800W，130℃煮2 min。隨后打開(kāi)鍋蓋，自然冷卻30 min。

隨后在每張切片上滴加IL－17抗體（Sant Cruz，美國(guó)，兔抗人多克隆抗體，SC－7927，稀釋比例1∶200），過(guò)夜后用PBS泡洗，滴加二抗和三抗（Ivitrogen，美國(guó)），DAB（中杉金橋）顯色，復(fù)染。

1.3 結(jié)果

光學(xué)顯微鏡（400倍）下觀察切片，抗體染色評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：組織切片以細(xì)胞漿染色淺棕黃色至棕褐色為陽(yáng)性。陽(yáng)性細(xì)胞百分率＜5%為0分，6%～25%記為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥75%記4分；著色強(qiáng)度，無(wú)著色為0分，淺棕黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；評(píng)分結(jié)果計(jì)算為：陽(yáng)性細(xì)胞百分率分?jǐn)?shù)×著色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)，所得分?jǐn)?shù)為0～1分時(shí)，分級(jí)為（－）；2～4分為（＋）；5～8分為（＋＋）；9～12分為（＋＋＋）。400倍光學(xué)顯微鏡下觀察切片，隨機(jī)取3個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞漿陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取其平均值來(lái)判斷IL－17的表達(dá)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，各組數(shù)據(jù)均以均數(shù)＋標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間比較使用非參數(shù)檢驗(yàn)，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

通過(guò)對(duì)95例結(jié)直腸癌組織和90癌旁組織的IL－17含量的檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)在癌組織中IL－17的含量明顯高于癌旁組織，在癌組織中有2例IL－17表達(dá)陰性，47例陽(yáng)性，46例強(qiáng)陽(yáng)性；而在癌旁組織中有33例IL－17的表達(dá)為陰性，48例為陽(yáng)性，沒(méi)有強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。隨后我們對(duì)37例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和58例無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和沒(méi)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組之間P＞0.05，IL－17的表達(dá)含量沒(méi)有明顯差異（表2）。另外，我們又按照分化程度，對(duì)中分化癌和低分化癌進(jìn)行比較，P＞0.05結(jié)果顯示IL－17的表達(dá)含量與分化程度沒(méi)有相關(guān)性（表3）。

表1 癌組織和癌旁組織IL－17含量對(duì)比Tab.1 Contents of IL－17 in Cancerous and paracancerous tissues

表2 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織IL－17含量對(duì)比Tab.2 Contents of IL－17 in lymph node meta static and non－metastatic tissues

表3 中分化腺癌與低分化腺癌IL－17含量對(duì)比Tab.3 Contents of IL－17 in moderately and poorly differentiated adenocarcinome

結(jié)腸癌組織中IL－17主要表達(dá)在細(xì)胞漿，并且IL－17的表達(dá)量與病人年齡，分化程度等并無(wú)相關(guān)性。

3 討論

IL－17作為一種促炎癥因子，于1993年首次被克隆出來(lái)，隨后被命名為IL－17［7，9－11］，后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)IL－17可以促進(jìn)自身免疫性疾病，并且促進(jìn)由炎癥介導(dǎo)的促腫瘤效應(yīng)。IL－17及其信號(hào)通路在乳腺癌，宮頸癌及結(jié)直腸癌中可以促進(jìn)這些腫瘤的發(fā)生過(guò)程。IL－17由CD4＋T細(xì)胞分泌，有六個(gè)亞型，分別 為 IL－17A，IL－17B，IL－17C，IL17－D，IL－17E，IL－17F。人類(lèi)的IL－17A是由150個(gè)氨基酸編碼的蛋白質(zhì)，其分子量為15k Da，借助二硫鍵結(jié)合形成分子量為30－35k Da的同源二聚體［7］。IL－17A 與IL－17F有60%的同源性，編碼IL－17A和IL－17F的基因位于6號(hào)染色體［7］。IL－17A 和IL－17F 都是由TH17細(xì)胞分泌的，TH17細(xì)胞還分泌IL－21，IL－10，IL－22在機(jī)體各個(gè)組織器官中起重要作用［12］。

IL－17的分化過(guò)程為：TNF－α通過(guò)刺激APC細(xì)胞分泌IL－6及IL－23，TGF－β與IL－23作用于TH17細(xì)胞通過(guò)活化的STAT3通路分泌IL－17。STAT3通路的活化誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）經(jīng)由NF－κB／Rel A直接轉(zhuǎn)錄活化IL－23p19基因分泌IL－23，并且STAT3的可以活化抑制腫瘤相關(guān)的DC細(xì)胞 中 NF－κB／c－Rel 依 賴 的 IL－12p35 基 因 的 表達(dá)［13］。另一方面，TH2細(xì)胞通過(guò)活化的STAT6通路分泌IL－4，IL－12，兩者作用于TH1細(xì)胞通過(guò)活化STAT4通路分泌IFN；一同抑制TH17細(xì)胞通過(guò)活化的 STAT3 通 路 分 泌IL－17［5，14－16］。同 時(shí) 腫 瘤 組織釋放的PGE2也能促進(jìn)TH2細(xì)胞分泌IL－4，同時(shí)PGE2也可以促進(jìn)TH17的分化過(guò)程。腫瘤組織釋放的TGF－β作用于Treg細(xì)胞抑制TH17的分化。IL－17刺激中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌IL－1，IL－6等細(xì)胞因子來(lái)促進(jìn)腫瘤血管生成，促進(jìn)腫瘤侵襲以及促進(jìn)腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。同時(shí)IL－17作用于炎癥局部可以促進(jìn)局部組織增生［5］。

目前的研究均證實(shí)，IL－17及其信號(hào)通路可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展。TH1細(xì)胞通過(guò)分泌IFN－γ來(lái)發(fā)揮抗腫瘤免疫功能，并且可以抑制TH17細(xì)胞的分化。從而抑制IL－17的促腫瘤作用。在敲除IFN－γ的小鼠黑色素瘤、膀胱癌模型中，IL－17的表達(dá)明顯增高，而且腫瘤生長(zhǎng)大小也明顯大于IFN－γ＋／＋的小鼠。在IL－17－／－的小鼠模型中，腫瘤生長(zhǎng)速度及腫瘤大小均小于IL－17＋／＋的小鼠，說(shuō)明IL－17的過(guò)量表達(dá)可以促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生。而且在IL－17－／－ 的小鼠中，磷酸化的 Stat3（p－Stat3）的表達(dá)量也明顯低于野生小鼠；而IFN－γ對(duì)Stat3的活化起抑制作用。并且IL－17對(duì)Stat3的下游靶基因Bcl－2和Bcl－XL有正調(diào)節(jié)作用［5］。同時(shí)，隨著腫瘤組織中IL－17的表達(dá)增加可以促進(jìn)如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，MMP9的表達(dá)增加，這些因子直接參與了腫瘤血管生成作用，對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)有重要意義。腫瘤組織中IL－17的過(guò)量表達(dá)也可以促進(jìn)炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，同時(shí)腫瘤組織中通過(guò)釋放PGE2對(duì)TH17細(xì)胞的分化有正反饋調(diào)節(jié)作用，使IL－17的促腫瘤作用不斷放大。

在IL－17的促腫瘤作用中有一個(gè)不可忽視的因素，信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄因子3。Stat3是Stat家族成員，具有很強(qiáng)的促腫瘤增殖，抗凋亡，促腫瘤血管生成作用。在腫瘤細(xì)胞中激活的Stat3促進(jìn)抗腫瘤免疫分子的表達(dá)，腫瘤組織自身也可以上調(diào)Stat3的表達(dá)，增加免疫抑制因子的表達(dá)如IL－6，IL－10，TGF－β，F(xiàn)OXP3 和 VEGF［17－19］。Stat3的持續(xù)高表達(dá)會(huì)抑制抗腫瘤免疫分子的表達(dá)。但是IL－17并不是直接激活Stat3，體外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，IL－17在腫瘤組織中首先是促進(jìn)IL－6的表達(dá)，隨后再經(jīng)由IL－6激活Stat3［15］。IL－6激活腫瘤組織中的Stat3后，可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞抗凋亡能力，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤血管生成作用，并且能夠抑制局部的促炎癥反應(yīng)。IL－17誘導(dǎo)的IL－6的高表達(dá)同時(shí)又可以促進(jìn)腫瘤組織中TH17細(xì)胞的分化，從而使整個(gè)促腫瘤反應(yīng)不斷放大反復(fù)循環(huán)。

本研究通過(guò)檢測(cè)人類(lèi)結(jié)直腸癌石蠟標(biāo)本中的IL－17含量進(jìn)一步證實(shí)，IL－17可以通過(guò)其信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展，我們的結(jié)果顯示，在癌組織中IL－17的含量要明顯高于癌旁組織，而且IL－17的表達(dá)增加并不是整個(gè)機(jī)體的表達(dá)水平增加，而是癌組織中的IL－17表達(dá)增加。這正說(shuō)明在癌組織中IL－17大量積聚，通過(guò)IL－17誘導(dǎo)的IL－6的表達(dá)使Stat3磷酸化，磷酸化的Stat3（p－Stat3）具有較強(qiáng)的促腫瘤細(xì)胞增殖，抗凋亡，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤血管生成作用，并且可以促進(jìn)上皮內(nèi)瘤變的發(fā)生，并且促進(jìn)上皮內(nèi)瘤變向癌的進(jìn)展［4］。由此我們推測(cè)，通過(guò)在癌組織內(nèi)增加IL－2，IL－4，IL－10，IFN－γ的含量以此來(lái)抑制TH17細(xì)胞的分化，還可以通過(guò)特異性阻斷癌組織中的IL－17，從而對(duì)抗IL－17的促腫瘤作用。從而為結(jié)直腸癌的分子靶向治療提供新的思路。

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